C3G在结直肠癌组织中的表达变化及意义

左忠林，陈鹏，姚晖，胡欣雨，徐亮，夏冬

西南医科大学附属第一医院，四川泸州646000

美国癌症学会发布最新全球癌症统计显示，至2018年全球结直肠癌新发病例超过110万、死亡病例达88万，成为全球发病率第3、死亡率第2的恶性肿瘤[1]。结直肠癌的发生发展大致经历从正常黏膜、腺瘤、腺癌到远处转移多阶段复杂过程，包含了多个癌基因的激活、抑癌基因的失活，涉及众多细胞信号通路的调节。探索新的靶点对结直肠癌早期预防、诊断、治疗、监测预后有重要意义。Ras相关蛋白1(Rap1)是Ras癌基因家族中的一种小分子三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白，其参与了细胞黏附、细胞连接功能、侵袭、迁移、外分泌、细胞极性、细胞凋亡和增殖等[2]，Rap1对信号传递的调控主要由Rap1鸟苷酸交换因子(GEF)和GTP酶激活蛋白(GAP)催化，GEF可使Rap1蛋白结合GTP引起蛋白构象成为活化状态(Rap1-GTP)，从而激活下游效应分子；GAP则可水解Rap1-GTP中的GTP并结合GDP，成为失活状态(Rap1-GDP)。Crk SH3域结合鸟嘌呤核苷酸交换因子(C3G)是第1个被发现的Rap GEF[3]。近年来有研究发现，C3G参与非小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、宫颈癌等恶性肿瘤的发生发展，但在不同肿瘤组织中C3G表达不一，所起效应也不相同。2019年4～9月，本研究探讨C3G在结直肠癌组织中的表达变化及意义。

1 材料与方法

1.1 组织标本来源 收集本院2012年11月～2013年12月手术切除的结直肠癌组织及其癌旁(距肿瘤边缘>5 cm)正常组织69例份，用于免疫组化法检测，均经病理检查确诊，患者男33例，女36例，平均年龄56.8岁。收集本院2019年5～8月经手术切除的31例份结直肠癌新鲜组织及配对的31例份癌旁正常组织(距肿瘤边缘>5 cm)，用于实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测，均经病理检查确诊。以上入组患者术前均未接受放化疗、免疫治疗等，并未合并其他系统恶性肿瘤，且临床及病理资料完整。本研究由西南医科大学附属医院伦理委员会批准，标本收集均在患者签署知情同意书(KY2019103)后进行。

1.2 结直肠癌组织及其癌旁组织中C3G表达检测 采用免疫组化法。标本经固定后石蜡包埋常规处理，切片经烘干，脱蜡、水化、高压、高温抗原修复，去过氧化物酶活性，血清封闭后，每片加入C3G一抗，4 ℃孵育过夜，PBS清洗，滴加二抗，37 ℃孵育，再次清洗，DAB显色，苏木素复染，盐酸乙醇分化，再次冲洗，氨水返蓝，流水冲洗，脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。染色结果采用双盲法由2名病理科医生判定，按染色强度及阳性细胞百分比进行评分[4]，染色强度无色为0分、淡黄色为1分、棕黄色为2分、棕褐色为3分；阳性细胞百分比为0计0分、≤10%计1分、11%～50%计2分、51%～75%计3分、>75%计4分。将以上两项评分相乘，4～12为蛋白表达阳性。

1.3 结直肠癌组织中C3G mRNA表达检测 采用RT-PCR技术。将TRIzol裂解液分别加入所需组织细胞中，提取总RNA，于65 ℃变性，提取RNA 0.5 μg，于逆转录混悬液中37 ℃孵育2 min后得到反转录产物cDNA，取cDNA 2 μL配制成PCR体系20 μL(BeyoFast SYBR Green qPCR Mix 10 μL，上下游引物混合液 2 μL，cDNA 2 μL，RNase-Free Water 6 μL)，反应条件：95 ℃预变性2 min，在95 ℃变性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40个循环后，经过95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s形成熔解曲线。每孔设置3个复孔，重复3次，结果采用2-ΔΔCt法计算目标基因相对表达量，取平均值。C3G上游引物序列5′-CCTTGGATCTGGAGCAGCA-3′，下游引物序列5′-GTCCCTGCTTCTCGATGGT-3′；内参GAPDH上游引物序列5′-CCTTGGATCTGGAGCAGCA-3′，下游引物序列5′-GTCCCTGCTTCTCGATGGT-3′。

1.4 随访 采用电话与临床查阅病历的方式随访，记录患者生存时间，随访日期截至2019年9月2日，其中C3G表达阳性患者失访5例，阴性患者失访2例。

2 结果

2.1 C3G在结直肠癌及其癌旁正常组织中的表达比较 C3G蛋白定位于细胞质和细胞膜内，阳性表现为黄色或棕黄色颗粒。在结直肠癌与癌旁组织中，C3G蛋白阳性表达率分别为60.87%(42/69)、34.78%(24/69)，比较差异有统计学意义(χ2=9.409，P<0.05)。结直肠癌组织中C3G mRNA相对表达量是癌旁正常组织的(5.86±2.03)倍，二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 结直肠癌组织中C3G蛋白阳性表达与患者临床病理特征的关系 C3G蛋白阳性表达与结直肠癌TNM分期(χ2=7.912，P=0.005)、肿瘤浸润深度(χ2=4.242，P<0.039)、淋巴结转移(χ2=14.621，P<0.001)、CEA水平(χ2=12.503，P<0.001)有关，与患者年龄、性别无关(P均>0.05)，见表1。

表1 结直肠癌组织中C3G蛋白阳性表达与患者临床病理特征的关系(例)

2.3 C3G蛋白表达与结直肠癌患者预后的关系 随访结果显示，截至2019年9月2日，C3G蛋白阳性表达42例，死亡25例，存活12例，失访5例；C3G蛋白阴性表达27例，死亡10例，存活15例，失访2例。通过Kaplan-Meier生存曲线分析，C3G蛋白阳性表达与阴性表达患者术后5年生存率分别为32.43%(12/37)、60.0%(15/25)，二者比较差异有统计学意义(χ2=4.612，P<0.05)。

3 讨论

C3G主要通过接受上游刺激信号，催化Rap1结合GTP并释放GDP发挥作用，由于是第1个被证明包含Cdc25同源模体的Rap GEF，又被称为Rap GEF1，相对分子质量为140 kD，在结构上主要由三部分模块组成：①C-端是GEF催化序列，包括Ras交换结构域和Cdc25同源结构域，负责向下游传递信号；②N-端残基有能与E-钙黏蛋白作用的序列，能够负向调控C3G活性；③中间则为脯氨酸富集域，并包含易被不同激酶磷酸化的酪氨酸残基504，能够与上游Crk、Hck、Cas、c-Abl等相互作用而被激活[3,5,6]。

C3G于1994年被Tanaka等[3]首次报道，Hirata等[7]率先在非小细胞肺癌中研究后发现，其在癌细胞中表达上调并通过Crk-C3G-Rap1信号通路导致肺癌的发生发展。之后的研究表明，C3G在不同癌组织细胞中表达、效应有所不同。在小鼠胚胎成纤维细胞中[8]，C3G作为一种抑癌基因可阻止多种致癌基因诱导的恶性转化；宫颈鳞癌中C3G表达减少并促进宫颈癌细胞增殖和侵袭，其原因与上游调控序列频繁甲基化有关[9]。但在高侵袭乳腺癌[10]、卵巢癌[11]、神经母细胞瘤[12]、慢性髓系白血病[13]、甲状腺乳头状癌[14]、肝细胞肝癌[15]等组织中发现C3G过表达，影响肿瘤的发生发展过程。

目前有关C3G在结直肠癌组织中表达的相关报道甚少。本研究发现，结直肠癌组织中C3G mRNA表达明显高于癌旁正常组织。在肝细胞癌的研究中，从癌症基因组图谱、正常组织与肿瘤组织中基因表达等不同数据库中收集分析肝癌患者mRNA信息发现，肝细胞癌组织中C3G mRNA表达较正常人增加，而转移性肝癌组织中C3G mRNA表达减少[15]；免疫组化染色结果提示，异常高表达的C3G主要定位于细胞质和细胞膜内，癌组织和癌旁组织中C3G蛋白阳性表达率分别为60.87%、34.78%，且C3G蛋白阳性表达与患者年龄、性别无明显相关性，但与CEA水平、是否发生淋巴结转移、肿瘤浸润深度及TNM分期等密切相关，这与Che等[11]在卵巢癌中的发现一致，说明C3G可能参与肿瘤增殖、侵袭、转移等过程，并能一定程度反映肿瘤恶性程度。但C3G表达上调是否会影响患者预后目前暂无相关报道，本研究对入组69例结直肠癌患者通过Kaplan-Meier生存曲线分析发现，C3G蛋白阳性表达患者术后5年生存率明显低于C3G蛋白阴性表达患者。Sequera等[15]在肝癌的研究中也得出了同样的结论，说明C3G高表达是患者预后不良的因素之一，但是否为影响预后的独立危险因素后续还将增加入组病例并进行多因素生存分析。

综上所述，C3G在结直肠癌组织中表达较正常组织上调，且对结直肠癌的发生发展具有一定促进作用。C3G高表达患者生存期明显短于低表达患者，因而可作为结直肠癌预后的监测指标。