致乌苏里母貉腹泻性疾病病原的检测分析

张召兴 刘少杰 贾青辉 张艳英 高贵生 史秋梅*

(1.河北旅游职业学院畜牧兽医系，承德，067000；2.河北科技师范学院 河北省预防兽医学重点实验室，秦皇岛，066604)

近几年，许多研究表明了寄生虫病和传染病对赤狐(Vulpesvulpes)、貉(Nyctereutesprocyonoides)、北美水貂(mustelavison)、宠物犬危害较大，尤其是肠道寄生虫病感染率和发病率较高，其肠道寄生虫病中以线虫病流行最为严重，主要临床表现为呕吐、贫血、严重腹泻，严重可导致死亡。因此，肠道线虫病成为危害毛皮动物主要的寄生虫病之一[1-2]。十二指肠钩口线虫(Ancylostomaduodenale)病是由钩口科(Ancylostomatidae)钩口属中的钩口线虫寄生宠物犬小肠肠道寄生线虫病，主要寄生于宠物犬十二指肠，吸附于肠壁上并吸取宠物犬的营养物质，该寄生虫可以引起不同日龄宠物犬发病，主要引起胃肠消化道功能紊乱、排血便、脱水、贫血、消瘦等，严重者可导致死亡[3-4]。大肠杆菌(Escherichiacoli)是动物和人主要条件致病菌之一，可以引起多种动物和人发病。貉大肠杆菌主要引起不同日龄貉急性或者慢性肠道传染病，其中以幼貉易感染，临床中主要以腹泻和败血症为主要症状，严重可导致急性死亡[5-6]。

2018年12月，昌黎县某养貉场，乌苏里母貉出现精神沉郁、厌食、眼结膜苍白、消瘦、排出带有血液的红色的水样粪便。为了鉴定引起母貉腹泻的病原，采集粪便及肛拭子病料组织进行病原的检测，为该病的治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源

2018年12月，昌黎县某养貉场，乌苏里母貉出现精神沉郁、厌食、眼结膜苍白、消瘦、排出带有血液的红色的水样粪便，采集其粪便及肛拭子，进行病原学检测。

1.2 主要试剂与仪器

动物线虫基因DNA组提取试剂盒、2×TaqMarker Mix、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购TaKaRa生物工程(大连)有限公司；DL2000 Marker购自北京中科瑞泰生物有限公司；犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬冠状病毒胶体金试纸条均购于上海快灵生物科技有限公司；大肠杆菌特异性生化鉴定试剂盒购于上海信帆生物科研所；药敏纸片购于常德比克曼生物科技有限公司。

1.3 实验动物

(25±2)g健康昆明系小鼠8只，由河北省预防兽医学重点实验室提供。

1.4 病毒性疾病胶体金试纸条检测

按照说明书，采集患病貉的粪便加入PBS中，离心取上清，用胶体金试纸条检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬冠状病毒抗原，采集血液分离血清，用胶体金试纸条检测犬瘟热病毒抗原。

1.5 线虫卵囊分离与形态学观察

采集的貉粪便，用饱和食盐水漂浮法收集线虫卵囊，取洗涤干净卵囊，400×倍带有标尺的显微镜下观察线虫虫卵形态结构，根据《小动物寄生虫病学》和《家畜寄生虫图谱》等[7-8]文献图谱确定线虫的种类。

1.6 线虫基因组的提取与PCR鉴定

王挺等[9]，根据GenBank中登录的线虫ITS基因序列，设计ITS基因保守区引物ITS-1：5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′，ITS-2：5′-TTAGTT-TCTTTTCCTCCGCT-3′引物由上海生工生物工程有限公司合成。用动物线基因DNA组提取试剂盒提取卵囊DNA组模板，用提取的DNA为模板进行PCR扩增与鉴定。将PCR产物送上海生工生物工程有限公司测序，其测序结果与GenBank中登录的钩口线虫基因序列进行同源性比较。

1.7 细菌学鉴定与药敏试验

1.7.1 细菌分离培养

采集患病貉的肛拭子及粪便样品经过处理后，无菌条件下接种于无菌的动物血培养基，在37℃恒温培养箱中培养12—18 h，选取动物血培养基上生长优势单个菌落接种于大肠杆菌特异性鉴定显色培养基进行鉴别培养，对大肠杆菌在普通营养肉汤中进行纯化培养后染色镜检观察其形态学。

1.7.2 分离菌株生化特性鉴定

按照说明书对分离的菌株进行生化特性试验鉴定。

1.7.3 细菌致病性试验

将8只小白鼠分成2组，试验组灌胃攻毒4只小白鼠，接种剂量为0.5 mL(107CFU/mL)，对照组的小白鼠给予等量的无菌普通营养肉汤，攻毒后观察7 d，并记录试验组和对照组小白鼠的发病及死亡情况，对死亡的小白鼠无菌条件下，取其病料组织进行细菌学鉴定。

1.7.4 药敏试验分析

按照CLSI推荐的标准K-B纸片法对分离菌株进行药敏试验。

2 结果

2.1 病毒性疾病胶体金试纸条检测结果

细小病毒抗原、犬冠状病毒抗原、犬瘟热病毒抗原胶体金试纸条检测均为阴性。

2.2 线虫卵囊分离与形态学观察结果

结果见图1。从患病的貉粪便中分离到卵囊，从400倍带有标尺的显微镜下观察线虫虫卵形态可见，该虫卵卵囊为无色透明的椭圆形虫卵结构，卵囊两端呈钝圆，卵囊壳薄，其卵囊的卵壳与卵内的细胞虫卵胞之间有较明显的空隙，卵囊的大小约为58—76 μm×35—41 μm，卵囊内有6—8个内细胞，呈桑葚状。《小动物寄生虫病学》和《家畜寄生虫图谱》等[7-8]文献图谱中报道的钩口线虫卵囊的形态和大小一致，初步鉴定为钩口线虫。

图1 貉钩口线虫虫卵形态结构(400×)Fig.1 Morphological structure of eggs of leptospira in mink(400 ×)

2.3 线虫PCR鉴定结果

用ITS基因保守引物扩增出大约为734 bp左右的目的基因片段(图2)，其测序结果后与GenBank中登录的钩口线虫ITS基因参考序列同源在98.9%—99.9%，因而证实了分离的线虫卵囊为钩口线虫。

图2 貉钩口线虫PCR鉴定结果Fig.2 Identification of racoon Nematode by PCRM：DL-2000 Marker；1—2：为样品 Samples

2.4 细菌分离鉴定结果

分离的菌株在动物血培养基上长出具有湿润的、灰白色的、大小一致的菌落；在大肠杆菌特异性鉴定显色培养基上长出了圆形、边缘整齐的、绿色的菌落；染色镜检结果显示，分离菌株的形态学与报道的大肠杆菌形态学一致。

2.5 分离菌株生化特性鉴定

从患病貉的体内分离到菌株发酵葡萄糖、麦芽糖、枸橼酸盐、甘露醇等，分离到菌株产酸不产气；分离菌株的吲哚试验和V-P试验均为阴性；生化特性试验结果显示，分离菌株被鉴定为大肠杆菌。

2.6 细菌致病性试验结果

在攻毒后的48—72 h，试验的小白鼠出现死亡率为75%，到试验后的96 h，死亡率为100%，从试验组死亡的小白鼠体内分离到大肠杆菌，对照组的小白鼠直到7 d试验结束健康存活，致病性试验结果表明，从患病的貉的体内分离到大肠杆菌具有致病性。

2.7 药敏试验

由表1可知，分离菌株对头孢曲松、头孢噻呋、美罗培南、左氧氟沙星4种药物敏感，对头孢他啶、恩诺沙星、大观霉素、林可霉素、阿米卡星5种药物中敏，对庆大霉素、阿莫西林、氨苄西3种抗菌药物耐药。

3 讨论

钩口线虫病传播途径广泛，主要以口感染为主，也可以通过胎盘传播，貉、犬等动物是多种人兽共患寄生虫的终末宿主和中间宿主，在饲养过程中与人们接触，可能多种人兽共患寄生虫病感染人，对人们的健康存在潜在威胁[10-11]。因此，在貉养殖过程中定期进行驱虫，同时还要注意环境卫生，减少相关寄生虫病发生与流行。大肠杆菌是在自然界分布广泛的一种人畜共患的条件病原菌，主要引起貉的腹泻和败血症，该病的传播与食物和环境密切相关，饲养管理不善、环境条件变化等应激因素，也可以引发该病的发生[12]。肖立荣等[13]研究表明从秦皇岛地区患腹泻的水貂体内分离了大肠杆菌，且对多种抗生素具有耐药性。张召兴等[14]研究表明从40多份送检的腹泻病貉体内分离鉴定出16株，对常用的抗菌药物具有不同的耐药性。

表1 药敏试验结果

Tab.1 Drug sensitivity test results

注：S.敏感，I.中敏，R.耐药

Note：S.indicates sensitivity，I.indicates moderate sensitivity and R.indicates drug resistance

本试验通过采集患腹泻病母貉的粪便、肛拭子和血液，通过胶体金试纸条检测犬细小病毒抗原、犬冠状病毒抗原、犬瘟热病毒抗原均为阴性，排除病毒性疾病的感染。在患病貉的粪便中分离卵囊，通过鉴定为钩口线虫，且分离到的大肠杆菌具有很强的致病性。因而证实了钩口线虫和大肠杆菌混合感染是引起母貉腹泻的主要因素。腹泻的母貉被诊断为钩口线虫病与大肠杆菌病混合感染。引起貉发病的因素很多，主要与食物和环境有关，因此，在貉养殖的过程中，应该注意食物新鲜度和环境的卫生，定期驱虫。针对貉钩口线虫和大肠杆菌混合感染，选择驱虫药物和对大肠杆菌敏感的药物结合治疗，同时应该注意环境的消毒。