2018年海南省北部沿海地区野鸟AIV与NDV监测

付 恬 林 江 孙 静 吕欣孺 李 祥 杨晓宇马沛然 李 仪 初 冬 耿海东 孙贺廷 谢林红彭 鹏 秦思源 冯尔辉 杨思远 孙 颖* 王玉龙* 柴洪亮*

(1.东北林业大学野生动物与自然保护地学院，哈尔滨，150040；2.海南东寨港国家级自然保护区管理局，海口，571129；3.国家林业和草原局森林和草原病虫害防治总站，沈阳，110034；4.黑龙江民族职业学院，哈尔滨，150066)

禽流感(avian influenza，AI)是由正粘病毒科(Orthomyxoviridae)流感病毒属的A型流感病毒引起的禽类的一种烈性的高度接触性传染病[1]。禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)不仅仅感染禽类，还可以跨越物种屏障感染哺乳动物，甚至人类。高致病性禽流感被世界动物卫生组织列为A类动物疫病，我国将其列为I类动物疫病。新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起禽的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病。以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征[2-3]。ND具有很高的发病率和病死率，是危害养禽业的一种主要传染病，OIE将其列入OIE疾病名录，我国将其列为I类动物传染病。

野鸟尤其是野生水禽是AIV和NDV的天然宿主，大多数学者认为野鸟在AIV和NDV传播过程中起着重要作用[4-5]。同域活动的带毒候鸟、留鸟与家禽之间，存在着交叉感染的可能性，这为病毒基因重组创造了机会。海南省位于全球8大候鸟迁徙路线中的东亚-澳大利西亚以及中亚-印度线上，是候鸟迁徙必须经过的停歇地以及越冬地。此外，海南更是以文昌鸡、嘉稷鸭闻名的我国重要的家禽养殖区域。

本研究选取海南省北部的海口与文昌地区的塔市村、道学、三江、竹山、旗调、贝坡、榜头等7个监测点于2018年2月中旬采集野鸟粪便样本，对海南北部地区野鸟携带AIV和NDV状况进行监测，进而掌握海南北部地区野鸟感染禽流感和新城疫病毒的基本情况。

1 实验方法

1.1 样品采集

于2018年2月中旬选取海南省海口到文昌两地的北部沿海地区为采样区域，包括塔市村、道学、三江、竹山、旗调、贝坡、榜头等7个沿海海边地点，总共采集了288份新鲜湿润的野鸟粪便样品(表1)，及时保存在含有样品保存液(成分：甘油、硫酸链霉素、青霉素钠、PBS)的离心管中，冷链运输至实验室。

1.2 样品处理

将采集到的粪便样品编号，振荡混匀，静置半分钟，取上清液200 mL置于新的离心管中，再加入抗生素，混合备用。

1.3 病毒分离

取处理好的样品，采用鸡胚尿囊腔接种法[6]，接种于9—11日龄SPF鸡胚尿囊腔中，每个样品接种2枚鸡胚，接种量为0.2 mL/枚，于37℃全自动孵化器中孵化72 h，每隔24 h照胚1次。弃去24 h内死亡的鸡胚，盲传两代，无菌条件下收获24—72 h内的死胚及活胚的尿囊液，备用。

1.4 血凝试验

血凝试验采用浓度为1%的SPF鸡红细胞悬液。对收取的尿囊液进行血凝试验[6]，测定血凝效价并记录。

1.5 RT-PCR试验

采用Trizol试剂法提取血凝阳性样品RNA，然后将RNA反转录为cDNA，用本实验室设计保存的AIV(M、NS、HA)和NDV(F、NDV1/2)特异性引物分别进行禽流感和新城疫病毒RT-PCR鉴定。以 cDNA为模板，按照如下体系扩增：10 μL 2×TaqPCR StarMix预混液，2 μL引物(上、下游引物各1 μL)，1.5 μLcDNA，用去离子水将体系补充至25 μL。RT-PCR反应程序设定30个循环，具体反应温度见表2。

表1 采样地点主要野鸟品种及采样情况

Tab.1 Main wild bird species and sampling conditions at sampling sites

表2 RT-PCR反应程序

Tab.2 RT-PCR amplification procedure

2 结果

2.1 血凝试验结果

样品接种SPF鸡胚，传胚两代，收取每一代尿囊液进行血凝实验。228份样品中只有2份样品为血凝阳性(2份样品分别采自道学站和竹山，当地常见野鸟品种为鸻鹬类和鹭类)，其余样品均显示血凝阴性结果。血凝阳性样品效价见表3。

表3 血凝试验结果

Tab.3 Result of the HA test

2.2 RT-PCR鉴定结果

将血凝阳性样品进行RT-PCR试验，然后进行琼脂糖凝胶电泳试验，通过凝胶成像系统观察结果。AIV鉴定引物M、NS、HA扩增的目的片段长度分别为1 020 bp、838 bp、640 bp；NDV鉴定引物F、NDV1/2扩增的目的片段长度分别为486 bp、375 bp。结果如图1—图5，阳性对照样品均出现相应的目的条带，而两份血凝阳性样品的结果均为阴性。

图3 HA640引物RT-PCR扩增结果Fig.3 RT-PCR amplification result of HA640 注：M.DNA标准DL2000；1.阴性对照；2—3.HA76、HA226；4.HA640阳性对照 Note：DL2000 DNA Maker.1.Negative control.2-3.Samples HA76，HA226.4.HA640 positive control

图4 NDV1/2引物RT-PCR扩增结果Fig.4 RT-PCR amplification result of NDV 1/2 注：M.DNA标准DL2000；1.1/2阳性对照；2—3.HA76、HA226；4.阴性对照 Note：DL2000 DNA Maker.1.NDV 1/2 positive control.2-3.Samples HA76，HA226.4.Negative control

图5 NDV F引物RT-PCR扩增结果Fig.5 RT-PCR amplification result of NDV F 注：M.DNA标准DL2000；1.阴性对照；2—3.HA76、HA226；4.F阳性对照 Note：DL2000 DNA Maker.1.Negative control.2-3.Samples HA76，HA226.4.NDV F positive control

3 讨论

近年来，世界各地相继暴发AI和ND疫情，AI和ND是家禽养殖业和野生动物种群健康的一大严重威胁，AI更是严重威胁人类健康的人畜共患病。在全球8条候鸟迁徙路线中，亚太地区的水鸟迁徙主要有3条通道，分别为西太平洋、东亚-澳大利西亚及中亚-印度，这3条通道都与中国鸟类迁徙有着密切关系[7]。海口与文昌两市地处海南省北部沿海地区，是东亚-澳大利西亚以及中亚-印度迁徙路线上重要的地理区域，是部分候鸟重要的越冬地，也是许多候鸟继续迁徙飞往东南亚国家途中的停歇地。海南地处热带，其温暖的气候与适宜的环境造成当地留鸟种类繁多。嘉积鸭和文昌鸡是海南特有的“四大名菜”之二，其相关养殖产业是海南重要经济来源，近年来文昌鸡更是向其他地区供应[8-10]。这为AIV、NDV在当地候鸟、迁徙留鸟及本地家禽之间循环传播及重组变异提供了便利条件，对AIV、NDV在当地的流行传播有着重大影响。因此对海南地区野鸟AIV、NDV携带状况进行流行病学监测具有重要意义。

海南省地处热带，气候属于热带海洋性季风气候。采集样品时正处于2018年2月中旬，属于初春时期，候鸟刚度过越冬期大部分还未开始向北方迁徙。采样时采样点的主要鸟类如鸻鹬类、鹭类均为候鸟，而八哥(Acridotherescristatellus)、珠颈斑鸠(Streptopeliachinensis)为当地留鸟，说明留鸟与候鸟之间相互存在着交叉感染的可能性。

本研究于2018年2月在海南北部地区总共采集了288份野鸟粪便样品，结果有2份样品呈血凝阳性，进一步采用RT-PCR试验鉴定结果显示AIV、NDV均为阴性。本研究可为海南北部沿海地区野鸟携带禽流感与新城疫病毒情况提供本底数据。2份样品呈血凝阳性，但AIV和NDV鉴定结果均为阴性，经分析可能原因如下：(1)本研究仅对AIV与NDV进行了检测，其他病原微生物如几种肠产毒素型大肠杆菌、鸡毒支原体、腺病毒等也含有血凝素，均能够引起鸡的血红细胞凝集现象，所以2份样品呈现血凝阳性，可能存在其他病原微生物。(2)禽流感病毒主要通过禽类的呼吸道分泌物和粪便大量排出，病毒可在0—4 ℃水中至少存活1个月、4 ℃粪便中存活35 d、37 ℃粪便中生存6 d[11]。当地气候温暖，温度较高，不适宜病毒生存，因此导致样品中分离不到AIV和NDV。(3)采样地点主要集中于北部偏东部海岸地区，采集样本数量较少，这也是没有检测到病毒的一种可能。其他原因如样品运输距离较远导致样品不够新鲜、采集时期不是疫情高发期等原因也有可能造成采集样品经检测均为AIV及NDV阴性的结果。

根据廖飞等[12]和解林红等[13]的研究，并结合本研究结果显示，近期野鸟不是海南北部沿海地区禽流感和新城疫的主要传播源，当地在近期不存在疫情暴发的高危风险。但是在候鸟越冬迁徙期仍需要对海南地区进行监测，尤其在海南周边邻国及国内地区的迁徙路线上暴发疫情时需严密监测，以便及时预警做好防控措施。