热休克蛋白在脊髓损伤中的研究进展

贺学岗,张广智,马占军,高一诚,郭旭东,康学文*

(1．兰州大学第二医院骨科,中国甘肃兰州730030;2．兰州大学,中国甘肃兰州730030)

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)通常是由外力作用于脊柱导致椎体骨折或移位造成的[1],可分为原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤是指外力导致的碎骨片、椎间盘或韧带等持续压迫或撕裂脊髓组织[2];继发性损伤包括原发性损伤所引起的炎症反应、组织水肿、电解质紊乱、自由基形成、脂质过氧化、神经元凋亡和兴奋性毒性神经递质的积累等[3]。目前关于SCI的治疗策略除手术解除压迫外,主要是限制继发性损伤的发生发展。

热休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)是一类在生物体内广泛存在的具有多种功能且高度保守的蛋白质[4]。当机体处于高温、炎症、缺血或氧化应激等状态时,HSPs作为保护细胞和组织免受进一步伤害的重要分子而大量合成[5]。在细胞内,HSPs主要分布于细胞质、细胞核、线粒体及内质网中,可以促进蛋白质二级和三级结构的形成,参与修复或清除受损变性的蛋白质,并介导信号传导、细胞凋亡、炎症反应及氧化应激等病理生理过程[6]。近年来研究发现,HSPs在继发性脊髓损伤阶段起着重要的保护作用,故本文对HSPs在脊髓损伤领域的研究进展予以综述,为后续相关研究提供参考。

1 热休克蛋白概述

1962年,Ritossa首次在果蝇唾液腺中发现HSPs,然而直到1986年,人们才逐渐了解其功能,并提出分子伴侣这一概念,它是指一类具有相同功能但序列不同的多肽,可以帮助其他蛋白质正确折叠和组装[7～9]。HSPs是生物体在应激后高表达的蛋白质之一,生理条件下其在细胞内表达相对较低,占总蛋白质含量的5%～10%,然而在应激情况下其表达可增至15%[10]。HSPs的相对分子质量在15～110 kD,根据相对分子质量的大小可将其分为以下几类:大分子HSP家族(100～110 kD)、HSP90 家族(83～90 kD)、HSP70 家族(66～78 kD)、HSP60家族、HSP40家族、HSP20家族(15～30 kD)及泛素等[11]。其中,研究最多的是HSP70,它是对应激最敏感的HSPs,具有两个结构域,在稳定蛋白质、信号传导、细胞凋亡、炎症及氧化应激等生理病理过程中起着重要的调控作用[12]。

2 热休克蛋白与脊髓损伤

继发性脊髓损伤在原发性损伤发生后的几分钟内开始,可持续数周或数月,引起病变部位及周围脊髓组织的进行性损伤[13]。Allen等[14]在1911年首次提出脊髓的继发性损伤这一概念。他在研究狗的脊髓损伤时发现,手术清除创伤后的血肿可以改善神经功能,故推测在坏死的出血性损伤中存在一些生化因素会对脊髓造成进一步的损伤,即继发性脊髓损伤。当然,脊髓损伤后机体也可产生一些保护性分子,促进其神经功能的恢复。相关研究表明,脊髓损伤后HSPs表达升高,并在继发性脊髓损伤阶段发挥着保护受损神经元的关键作用[12]。

2.1 脊髓损伤后热休克蛋白的诱发因素

HSPs在生理情况下表达较低,当机体处于应激状态时作为保护性分子大量表达[15]。其表达主要由热休克转录因子(heat shock transcription factors,HSFs)介导。HSFs通过其氨基末端结构域与HSPs编码基因5′端启动子中的热休克元件(heat shock element,HSE)序列特异性结合来调控HSPs的表达[16],其中HSF1是调节HSPs表达的必要因子。在生理条件下HSF1与HSPs结合,当细胞处于应激状态时两者相互脱离,HSPs发挥作用,而游离的HSF1被蛋白激酶C磷酸化并转移到细胞核内形成活化的三聚体,活化的三聚体与HSE结合从而生成更多的HSPs[17]。脊髓损伤后机体产生的神经酰胺、活性氧(reactive oxygen species,ROS)及错误折叠的蛋白质等可以通过活化HSFs诱导HSPs的表达。

2.1.1 神经酰胺

神经酰胺是一种结构简单的鞘脂,由长度不等的脂肪酸与鞘氨醇的氨基缩合而成,是细胞膜的结构成分之一[18]。神经酰胺可以作为信号分子,将细胞外压力转化为细胞内信号[19]。静息细胞细胞膜中的神经酰胺水平较低,当受到应激(如SCI)时可显著增多[20]。在丝氨酸残基、乙酰转移酶及调节蛋白作用下,神经酰胺可以将HSFs磷酸化,启动HSPs的转录[21]。Han等[22]研究显示,Malme-3M黑色素瘤细胞经神经酰胺作用后,其HSP70的表达明显升高,这提示神经酰胺可以促进HSPs的产生。脊髓损伤后,神经元及胶质细胞等细胞的细胞膜骨架遭到破坏,神经酰胺大量表达,进而激活HSFs,促进HSPs的产生。

2.1.2 活性氧

ROS主要由细胞内线粒体产生,包括超氧阴离子(O2·-)、过氧化氢(H2O2)、羟基自由基(·OH)和一氧化氮(NO)等,是细胞氧化代谢的副产物,正常情况下与体内抗氧化剂处于平衡状态[23]。在氧化磷酸化过程中,线粒体消耗了细胞90%左右的氧气(O2);当线粒体功能发生障碍时,电子能与更多的O2结合产生ROS[24]。脊髓损伤后,线粒体结构被破坏,功能发生障碍,ROS生成增加。此外,小胶质细胞、巨噬细胞及中性粒细胞也参与了ROS生成[23]。相关研究表明,H2O2可以直接激活HSF1,从而促进HSP70和HSP90的mRNA表达[25]。Ahn等[26]研究表明,ROS可以体外激活HSFs,HSF1通过H2O2的氧化而被多聚化,并与DNA结合,进一步促进HSPs表达。

2.1.3 蛋白质的错误折叠

内质网是蛋白质合成与折叠的场所,SCI可引起内质网功能紊乱,导致蛋白质折叠错误。此外,脊髓损伤后增加的ROS也可以诱导蛋白质错误折叠。蛋白质的错误折叠和聚集可以导致神经毒性累积,并引发炎症反应和细胞凋亡。正常情况下,细胞可以通过蛋白酶体及自噬系统将错误折叠的蛋白质清除[27],当机体不能及时清除时就会诱导c-Jun氨基端激酶2(c-Jun N-terminal kinase 2,JNK2)活化,活化的JNK2可以使HSF1磷酸化,并激活HSF1和HSF2的转录活性,从而促进HSPs 的表达[28～29]。

2.2 热休克蛋白在脊髓损伤后的保护作用

2.2.1 分子伴侣作用

HSPs作为分子伴侣,可以促进蛋白质的正确折叠,同时也可以清除错误折叠的蛋白质。HSPs可以与核糖体上新生肽链的疏水氨基酸短序列结合,防止新生肽链在完全合成之前错误折叠,并能阻止相邻肽链上疏水氨基酸间因相互作用而发生的聚集,促进蛋白质的正确折叠。泛素可通过与错误折叠的蛋白质相结合而使其泛素化,进而使其被蛋白酶体识别并降解。SCI可导致蛋白质聚集体的错误折叠和积累。Cuesta等[30]证明HSP27可以作为细胞蛋白质合成的抑制剂;他们发现,HSP27与一种被称为eIF4G的转录起始因子相互作用,并阻止eIF4G因子启动翻译,而eIF4G是大多数细胞RNA转译所必需的。这种相互作用可能是一种保护机制,从而进一步限制蛋白质在应激条件下错误折叠的积累。在细胞内,细胞骨架的主要功能是维持细胞的正常结构和生长,HSP27可与细胞骨架肌动蛋白微丝结合,从而稳定细胞骨架结构,防止其解体。这可能是对细胞环境变化的适应性反应[31]。

2.2.2 促进血管生成

脊髓损伤后,大的血管如脊髓前动脉通常保持完整,而较小的髓内血管和毛细血管则容易受损,导致白细胞和红细胞外渗,进而导致炎症、脊髓能量供应不足、缺氧和随后的细胞线粒体功能障碍[32]。研究表明,HSPs参与了脊髓损伤后新生血管的形成。一项基于内皮细胞的体外研究发现,HSP27与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)有着复杂的相互作用。细胞应激后,VEGF通过激活应激活化蛋白激酶2(stress-activated protein kinase 2,SAPK2)/p38途径促进HSP27的磷酸化,从而使细胞骨架重组和内皮细胞迁移,促进血管新生[33]。此外,HSP27的磷酸化减少了细胞外HSP27的释放,而细胞外的HSP27可以与VEGF结合,阻止VEGF的表达[34]。HSP27也可以通过与内皮细胞上Toll样受体3的结合增强细胞内VEGF的表达[35]。因此,HSPs通过与VEGF相互作用,促进脊髓损伤后新生血管的形成。

2.2.3 抑制炎症反应

脊髓损伤后小胶质细胞、T细胞和星形胶质细胞激活并向损伤部位趋化聚集,同时它们合成并释放的炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β、IL-8等)迅速增多,加重神经元的凋亡和血脊髓屏障的破坏,导致脊髓组织进一步损伤[36]。Kim等[37]在大鼠自身免疫性脑脊髓炎模型中发现,体外应用的HSP27具有抗炎作用。在巨噬细胞中,HSP27可以通过上调核转录抑制因子来抑制核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)的表达,进而阻止巨噬细胞的活化[38]。在单核细胞中,沉默HSP27可以使IL-1的表达增多,这表明HSP27可以通过抑制单核细胞表达IL-1来抑制炎症反应[39]。Chamney等[40]研究表明,小鼠脊髓损伤后,HSP70的上调可以显著降低肌肉中IL-6和TNF-α的表达。Huan等[41]发现,宝珍丸可以诱导HSP27的表达,从而降低SCI大鼠Treg细胞比例,进一步减少TGF-β的表达。因此,脊髓损伤后活化的HSPs可通过抑制炎症因子的表达减缓脊髓组织的进一步受损。

2.2.4 抑制细胞凋亡

脊髓损伤后可以通过激活多个信号通路引起细胞凋亡。胱天蛋白酶(caspase)在细胞凋亡过程中起着关键作用,其在细胞内以非活性前体酶原的形式存在。凋亡启动后,线粒体膜间隙的细胞色素c穿过线粒体膜到达胞质,与dATP和凋亡蛋白酶激活因子1(apoptosis protease-activating factor-1,Apaf1)形成凋亡体,凋亡体募集pro-caspase-9并将其激活,活化的caspase-9通过自身的caspase级联反应激活caspase-3和caspase-7,进而使蛋白质水解,导致细胞凋亡。此外,细胞外的损害因子(如TNF-α等)可与细胞膜表面受体结合并募集胞内的Mort1(一种死亡域蛋白)形成复合体,激活caspase-8,进而激活caspase-3,引起细胞凋亡[3]。研究表明,海藻糖可以通过上调HSP27和HSP70抑制细胞色素c的释放,并降低caspase-3的表达,从而起到保护脊髓的作用,使其免受损伤[42]。在线粒体外,HSP70与Apaf1结合,从而阻止pro-caspase-9募集到凋亡小体[15]。此外,HSP70还可以通过结合肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体1和2(TNF-related apoptosis inducing ligand-receptor 1/2,TRAIL-R1/2)来阻止细胞凋亡[43]。Bcl-2家族蛋白中的Bcl-2是细胞凋亡的负调控因子,它可以阻断细胞色素c和凋亡诱导因子在线粒体的释放。在神经元缺血的模型中,HSP70可通过增加Bcl-2的水平抑制凋亡[44]。Chang等[45]通过运动预处理SCI大鼠发现,受损的脊髓灰质中神经元和星形胶质细胞可以通过过表达HSP72来抑制凋亡,促进SCI大鼠神经功能恢复。

2.2.5 抗氧化应激作用

如前所述,脊髓损伤后神经元和胶质细胞线粒体功能的丧失,以及小胶质细胞和中性粒细胞的激活,使得ROS产生增加。而ROS的积累能够分解蛋白质、过氧化脂质和损伤DNA,进而诱发神经元凋亡[46]。相关研究表明,HSP70能够促进抗氧化剂过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽等的表达。在胶质细胞中,HSP70的过表达可以使细胞免受葡萄糖剥夺和H2O2的损伤,这与谷胱甘肽的产生增加有关[47]。Wang等[48]研究发现,采用低频脉冲电磁场治疗SCI大鼠时可以上调HSP70的表达,并能增加过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的产生,降低诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和ROS的水平。此外,HSP70可以阻止ROS诱发的DNA碎片化,保护细胞使其免受H2O2诱导的氧化应激[5]。因此,脊髓损伤后HSPs表达增加可以通过促进抗氧化剂蛋白质的产生和阻止DNA碎片化等来提高脊髓神经元的抗氧化应激能力。

2.3 热休克蛋白治疗脊髓损伤的研究现状

近年来,国内外学者在通过诱导HSPs产生来治疗SCI方面进行了大量研究。如上所述,Huan等[41]发现,宝珍丸可以通过诱导HSP27的表达来抑制脊髓损伤后的炎症反应。Nasouti等[42]研究表明,海藻糖可以通过上调HSP27和HSP70的表达抑制神经元凋亡。Chang等[45]通过运动预处理SCI大鼠发现,过表达HSP72能够抑制星形胶质细胞和神经元凋亡。此外,Tanabe等[49]发现,苦参碱可以直接激活细胞外HSP90,进而促进急性SCI小鼠轴突的生长和功能恢复。Huang等[50]研究表明,高压氧治疗可以促进HSP32的表达,进而增加大鼠原代脊髓神经元抵抗氧化或糖氧剥夺损伤的能力。总的来讲,虽然HSPs在SCI治疗方面的研究已经取得了一些进展,但由于HSPs保护机制的多样性和SCI疾病的复杂性,当前诱导HSPs产生的机制并不是十分清楚。因此,探索HSPs产生及作用的深层机制,并研发HSPs诱导效率高、毒副作用小、经济成本低的药物将是今后研究的重要方向。

3 展望

综上所述,HSPs与脊髓损伤后神经功能的恢复密切相关。脊髓损伤后,HSPs作为保护性分子表达增高,发挥分子伴侣、促进血管生成、抑制炎症反应、抑制细胞凋亡、抗氧化应激等作用,从而减缓脊髓损伤的进一步加重,这为基于HSPs治疗SCI提供了一条新的思路。现阶段,如何诱导脊髓损伤后HSPs的表达,进而促进神经功能的恢复是SCI领域的研究热点之一。虽然有关药物、运动、高压氧等诱导HSPs表达的研究已有一定的进展,但仍未有临床应用的报道。因此,探索促进HSPs表达的机制及其对SCI的保护机理仍是今后研究的重点。