卵巢早衰的细胞凋亡机制及针灸干预研究进展

蔡靓，李丽，赵以琳，宗道宽，刘希茹，童国庆

(上海中医药大学附属曙光医院生殖医学中心，上海 201203)

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)被定义为40岁之前卵巢功能出现衰竭的状态，闭经时间≥4～6个月或两次月经间隔4周以上，FSH>40 U/L，伴有雌激素降低及绝经症状。随着社会经济的飞速发展，女性生育年龄的推后，以及环境与疾病的各种影响，POF的发病率逐年升高[1]。诱发卵巢衰老的原因包括遗传、DNA损伤修复、端粒、能量代谢、神经内分泌、卵巢微环境等因素[2]。但大多数POF患者仍无法找到具体原因，即不明原因POF。在POF早期发生的卵泡闭锁过程中，卵母细胞首先发生凋亡，卵泡颗粒细胞由内层向外层逐渐凋亡；而生长晚期的卵泡，颗粒细胞首先凋亡，诱导卵母细胞凋亡，触发了卵泡闭锁。因此不论何种原因导致的POF，卵巢中卵母细胞与颗粒细胞的凋亡都是POF发病的重要因素。目前激素替代疗法(hormone replacement therapy，HRT)是最基本的治疗方法之一。但最近一些研究表明，接受HRT治疗也会伴随不良作用[3]。近年来，祖国医学应用于此类疾病的治疗案例屡见不鲜，针灸在治疗妇科疾病如子宫肌瘤、多囊卵巢综合征(PCOS)等中成功的例子也多有报道。因此本文中，我们探讨了POF发生发展中细胞凋亡的作用机制以及针灸干预治疗POF的潜在效应。

一、细胞凋亡诱导POF的发病机制

POF的发生与细胞凋亡有密切关系。卵母细胞的成熟依靠卵巢和卵泡微环境自身稳态的维持。颗粒细胞产生多种物质支持卵母细胞的生长成熟，卵母细胞也分泌多种细胞因子作用于颗粒细胞表面上相应的受体，促进颗粒细胞的增殖和分化，卵母细胞和颗粒细胞间在卵泡发育的不同阶段都存在着联系[4]。二者之间的共同作用参与调节卵泡成熟及排卵的过程，该过程涉及到多种信号通路，如cAMP、PI3K/AKT、mTOR、MAPK、Beclin-1/Bcl-2等[5]。颗粒细胞的凋亡也会导致卵母细胞凋亡。卵母细胞与颗粒细胞的凋亡共同促进卵泡闭锁加速，从而导致POF。但是基于卵巢特有的生理环境和卵泡发育过程，其凋亡的发生又有着特殊的调控因素和模式[6]。

近年来有研究提示氧化应激可能在POF的发生发展中具有重要作用。Yu等[7]的研究显示，亚砷酸钠可通过氧化应激和对类固醇代谢的影响引起卵母细胞凋亡，从而进一步导致大鼠卵泡的闭锁。Tokmak等[8]研究发现POF患者血清中的诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)和总抗氧化状态(total antioxidant status，TOS)水平高于健康的育龄女性，均提示氧化应激参与了POF过程。

二、卵巢颗粒细胞凋亡的内在机制

卵泡颗粒细胞的增殖和分化是卵泡发育成熟的基本条件，颗粒细胞为卵母细胞供给生长发育所需的大部分营养，颗粒细胞的状态对卵母细胞质量及胚胎发育潜能有很大影响，其凋亡异常直接导致卵泡发育异常[9]。颗粒细胞凋亡是卵泡闭锁的重要因素之一[10]，正常情况下颗粒细胞分裂增殖和凋亡共同存在，当颗粒细胞凋亡率达到一定程度时卵泡闭锁发生。而一定数量的卵泡同时发生闭锁，就会导致POF。与普通细胞一样，颗粒细胞的凋亡也是细胞程序性死亡，具有凋亡的形态学特征和分子生物学变化：从接受凋亡信号到凋亡调控分子间相互作用再到蛋白水解酶caspase活化，最后进入连续反应过程。有研究报道卵泡颗粒细胞凋亡与Fas/FADD信号通路及B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)的表达密切相关[11]。

1.颗粒细胞凋亡的线粒体途径：线粒体途径，又称内源性途径，指当细胞受到各种因素影响时，如细胞缺氧、癌基因被激活、DNA损伤、氧化应激反应的发生等，会改变线粒体膜的通透性，使促凋亡因子[如细胞色素C(cytochrome C，Cyt C)]穿透线粒体膜，激发细胞凋亡级联反应[12]。

Bcl-2家族对卵巢颗粒细胞凋亡起决定作用，Bcl-2家族蛋白存在于免疫、神经、内分泌系统等正常组织中，亦存在于人卵巢组织中，位于线粒体外膜、内质网膜和核膜上。研究显示Bcl-2家族通过线粒体途径调控颗粒细胞的凋亡：(1)作用于抗凋亡蛋白，如Bcl-2等：通过抑制促凋亡蛋白Bax的线粒体膜透化作用来阻碍细胞凋亡，若抗凋亡蛋白的表达被抑制，则会促进颗粒细胞凋亡[13]；(2)作用于促凋亡蛋白，如Bax和Bak：在细胞受到凋亡刺激因子作用后被激活，结合到线粒体外膜并在线粒体外膜上形成25～100 nm的圆形孔道[14]，促使Cyt C和其他促凋亡因子穿透线粒体膜进入胞质，诱发凋亡；(3)作用于BH3-only蛋白：此类蛋白能够直接激活Bax或Bak，导致细胞凋亡[15]。

2.颗粒细胞凋亡的死亡受体途径：细胞凋亡的外源性信号通路是通过死亡受体介导的，死亡受体属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族，其胞浆区有一个具有蛋白水解功能的同源氨基酸残基结构，称为“死亡区域”(deathdomain，DD)。其介导的信号转导途径主要有3条，分别为TNFR、TRAIL和Fas/FasL信号途径。以Fas/FasL信号途径为例，FasL和Fas结合激活的受体与FADD结合，形成死亡诱导信号复合体(death inducing signalling complex，DISC)，从而激活下游的Caspase分子，诱发细胞凋亡的发生[16]。另一方面Fas激活的Caspase-8会进一步激活Bcl-2家族成员，致使线粒体外膜透化(mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP)的发生，线粒体释放Cyt C，引发下一步级联反应[17]。

Fas配体(Fas ligand，Fas-L)和Fas，两者均表达于颗粒细胞，是死亡受体途径中最常见的引起颗粒细胞凋亡的蛋白。林鹏飞等[18]检测颗粒细胞中Fas-FasL mRNA的表达，发现Fas、Fas-L mRNA的表达随细胞培养时间的延长而增高，由此可推测Fas/Fas-L通路的激活有可能是引发颗粒细胞凋亡的重要因素之一。

3.细胞凋亡的内质网途径与ROS蛋白：内质网途径(endoplasmic reticulum signaling，ERS)主要是内质网应激导致Ca2+超载或者稳态失衡，可以有两种途径诱发凋亡，一是直接激活Caspase分子，二是激活Bax和Bak，诱发线粒体凋亡的级联反应，这也可以看作是凋亡内源性途径的补充。目前研究发现，由内质网应激导致细胞凋亡的途径有2条，一是CHOP(C/EBP homologous protein)凋亡途径，二是Ire1-JNK(c-Jun N-terminal kinase)凋亡途径[19]。活性氧分子(reactive oxygen species，ROS)和Ca2+的相互作用对凋亡发生与发展有重要影响，ROS过多会激发内质网应激途径的细胞凋亡[20]，细胞内的多种结构都含有丰富的Ca2+，内质网应激发生时，内质网会释放Ca2+，从而线粒体内Ca2+也会增加，诱导线粒体产生ROS，导致线粒体功能障碍，最后导致凋亡。

ROS是氧化应激诱导细胞凋亡的重要因素，机体在正常情况下会产生少量ROS，ROS的产生和机体的抗氧化能力之间的平衡打破时，引起卵泡闭锁，最终导致POF。

4.诱导颗粒细胞凋亡的其他相关蛋白：还有一些其他蛋白参与颗粒细胞的凋亡，比如NF-kB、FOXO3(forkhead box O3)、髓细胞瘤病毒癌基因(myelocytomatosis viral oncogene，Myc)和p53。研究发现，NF-kB能够调控细胞的调亡，NF-kB能上调凋亡基因Fas、c-myc及TNF-α的表达，引起细胞凋亡[21]。FOXO3是FOXO的转录因子，上调FOXO3的表达能够诱发颗粒细胞凋亡，促进卵泡的闭锁。研究显示，Myc蛋白可能具有促进颗粒细胞凋亡的作用，进而诱导卵泡膜细胞的凋亡[22]。Liang等[23]研究指出，p53促进颗粒细胞凋亡的机制可能是p53抑制颗粒细胞内由转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的有关pri-miRNA的表达，继而通过pri-miRNA影响卵巢颗粒细胞的生长、发展和凋亡的过程。p53的一个同系物TAp63作为DNA损伤凋亡通路的关键调控因子，与磷酸化的c-Abl(一种原癌基因)相互作用，级联激活Bax和Bak，诱发颗粒细胞凋亡级联反应。

三、卵巢卵母细胞凋亡的内在机制

1.卵母细胞凋亡的途径：卵母细胞的凋亡主要是通过线粒体途径及死亡受体途径，其过程与发生在颗粒细胞中的凋亡类似。Bcl-2家族在卵母细胞的生长发育过程中发挥着重要作用。有研究表明抗凋亡因子Bcl2-L10在卵母细胞中具有特异性表达，对卵母细胞的发育、成熟及受精都有重要影响，对于卵母细胞的减数分裂过程有关键作用[24]。在衰老的卵母细胞中，促凋亡因子Bax通过中和Bcl2-L10加速卵母细胞凋亡进程，Bax表达的升高激活后续caspase级联凋亡反应，卵母细胞出现凋亡相关的生化和形态学改变[25]。

卵母细胞凋亡的死亡受体信号通路主要由肿瘤坏死因子受体家族FAS和TNFR1介导，与它们的配体(Fasl和TNFa)结合后被激活。研究表明大鼠卵母细胞中，磷酸化Thr161 Cdk1(cyclin-dependent kinase 1)水平的降低，推动Fasl介导的卵母细胞凋亡，激活一系列后续级联反应，最终激活caspase-3导致卵母细胞凋亡[26]。活化的caspase-3切割关键结构及调节相关蛋白，导致DNA被破坏，这些被破坏的DNA片段能够在凋亡的卵母细胞中被检测到[27]。

2.ROS对卵母细胞凋亡的影响：ROS的产生或抗氧化系统的缺失也易导致卵母细胞的凋亡。ROS可导致线粒体膜电位的下降及线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，mtPTP)的开放，使Cyt C从转换孔中释放，与凋亡激活因子-1(apoptosis activating factor-1，Apaf-1)结合，活化caspase-9，激活下游的效应caspase，启动细胞凋亡。研究表明，Bcl-2蛋白家族中促凋亡蛋白，如Bcl-2、Bcl-XL，能够促进mtPTP的开放，激活卵母细胞凋亡级联反应[28]。研究发现，Ca2+载体(Ca2+ionophore，CI)通过增加细胞内Ca2+水平诱导ROS产生而导致小鼠卵母细胞的凋亡，cAMP和cGMP水平的降低也可增加Ca2+水平而诱导ROS产生[29]。ROS持续产生可导致氧化应激，氧化应激降低了双线期和MⅡ阻滞期卵母细胞内的存活因子和成熟促进因子(maturation-promoting factor，MPF)的不稳定性，持续降低MPF的不稳定水平可激发卵母细胞的凋亡[30]。

四、针灸干预POF的作用机制

近年来有研究表明，针灸具有抗氧化、调节自由基代谢，调节内分泌、抗衰老、抑制细胞凋亡、改善卵巢与子宫微环境、促进卵泡成熟等多种改善POF症状、延缓POF进程的作用[31]。有研究探讨了针灸抑制卵巢细胞凋亡的机制，选取符合围绝经期特征的雌性大鼠为对象，采用针刺大鼠肾俞、足三里、三阴交穴位治疗，与未接受针刺的大鼠对比发现，针刺治疗后围绝经期大鼠卵巢颗粒细胞 Fas mRNA表达明显降低，而Bcl-2 mRNA表达明显提高[32]。郑艳华等[33]也发现低频电针能够降低大鼠卵巢组织中Bax的蛋白表达，下调Bax/Bcl-2比值；卵巢染色切片发现，接受针刺的大鼠卵巢可见多个黄体存在，囊性卵泡减少，颗粒细胞层明显增厚。可以推测，针灸可能是通过线粒体途径和死亡受体途径抑制卵巢细胞凋亡，改善卵巢微环境，从而延缓POF的进程。

PI3K/Akt通路通过抑制细胞的凋亡，增加细胞的存活率，在减轻氧化应激损伤中发挥着重要的作用；当PI3K/Akt通路遭到影响，会增加氧化应激的发生，抑制细胞增殖，进一步激发凋亡级联反应[34]。有研究以环磷酰胺腹腔注射SD雌性大鼠建造POF动物模型，将造模成功的大鼠分组后针刺干预，发现针刺组成熟卵泡数量增加，血清E2水平提高，FSH下降明显，相关信号通路的PI3K、Akt和mTOR mRNA的表达量呈升高趋势，表明针刺对于POF的治疗具有一定效果；其作用机制可能与上调PI3K/Akt通路的相关基因有关[35]。

p53在卵巢颗粒细胞凋亡中也起了重要作用。许多凋亡因子基因启动子可与p53结合，激活后续级联反应，促使凋亡相关因子Fas、FasL、促凋亡蛋白Bax等表达增高，诱导细胞凋亡。相珊等[36]研究发现，电针治疗可以提高行IVF-ET的不孕症女性获胚数及优质胚胎率，并且可以下调其卵巢颗粒细胞中p53 mRNA、Bad mRNA的表达。由此推测电针治疗可以通过下调p53及Bad的过表达达到抑制卵巢颗粒细胞凋亡、保护卵巢功能的效果。

郑艳华等[37]发现低频电针能够降低大鼠血清性激素结合球蛋白(sex hormone-binding globulin，SHBG)、β细胞功能指数(modified βcell function index，MBCI)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)及血糖水平，其机制可能是通过调节胰岛β细胞的功能，减少氧化应激反应的发生。有研究报道房繄恭教授的“调经促孕针法”在促进排卵及恢复卵巢功能的治疗上，也取得了很好的临床疗效，其机制在于“调经促孕针法”能够下调血清FSH、LH水平，从而达到改善POF的效果[38]。针灸可以通过减轻氧化应激改善卵巢与子宫的功能，延缓卵巢与子宫的衰老进程，可能是针灸治疗POF的机制之一。

五、结语

综上，HRT的治疗方案虽仍是目前治疗POF的经典方法之一，但激素潜在的致癌作用、影响肝肾代谢、增加血栓等风险限制了其长时间应用[39]。治疗后一旦停止用药，病情就容易反复，这些问题增加了POF患者的心理负担，降低了依从性，使治疗难以坚持，也限制了其长期应用。现有多个研究证明针灸治疗能调节人体内分泌及代谢水平，明显减少卵巢中发生的氧化应激反应，降低卵巢颗粒细胞及卵母细胞的凋亡；并通过延缓细胞的凋亡，来调节卵巢颗粒细胞的分泌功能，调控卵泡的发育，延缓卵巢衰老，降低POF的发生率。本文中，简要介绍了针灸干预POF细胞凋亡途径的作用机制。传统中医手段干预POF的发生发展，吸引了越来越多的关注，但这些治疗方法仍缺乏高质量控制的临床试验评估以及深入的机制研究。如果将针灸与HRT联合应用，可能会提高POF的治疗效果，降低HRT疗法的不良反应，也许是综合医学的又一突破。鉴于POF女性对于HRT和自然疗法的需求，有必要进一步研究针灸的作用机制，也需要更多证据来支持传统中医疗法在POF治疗中的应用。