不同癌症核酸适配体筛选的研究进展

李名一，姜良勇，高 川，刘媛媛

(1.佳木斯大学附属第一医院肿瘤科，黑龙江 佳木斯 154004；2.佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007)

癌症是世界上最常见的恶性肿瘤之一，也是导致人类死亡的主要原因之一，对人类健康和生命构成极大威胁。近年来，随着人口老龄化，发病率和死亡率将整体继续呈上升趋势，我国癌症防治面临严峻的形势[1]。然而癌症早期的体征和症状特异性不明显，各种肿瘤标志物也较少，难以实现早期诊断，同时癌症的治疗，比如手术切除不彻底、复发率高和转移率高等是影响癌症治疗效果的主要问题。因此，从分子水平上发展分子靶向药物及免疫治疗药物，可以大大提高癌症病人的治疗效果。核酸适配体横空出世，它俗称“核酸抗体”[2]，区别于相应的蛋白质抗体。这个术语是由于抗体和适配子之间的相似性而产生的，它可以是单链 DNA，也可以是RNA，由于其良好的选择性，还有对靶标的高亲和力，适配子作为分子探针在确保食品安全、环境监测、疾病诊断和治疗等方面具有相当大的潜力。它具有与单克隆抗体相匹敌的蛋白质靶标的亲和力和特异性。此外，适配子与抗体相比有一定的优势，因为它们可以化学合成，并且可以引入修饰来提高它们的稳定性和药代动力学特性。一些针对治疗重要靶点的适配子已经在细胞和动物模型中显示出有效性，少数适配子现在正在进行临床试验或正被用作药物。因此适配子作为一类用于疾病诊断和治疗的新型分子探针引起了人们的极大关注，因此我们研究各种癌症的核酸适配体来用于疾病的治疗。

1 与乳腺癌相关的核酸适配体

乳腺癌是女性最常见的癌症，它是女性中最常见的癌症，它是当今女性癌症死亡的第二大原因，仅次于肺癌。乳腺癌的有效和成功治疗的关键是及时的诊断。鉴于癌症的复杂性和多样性，为了提高灵敏度和选择性，有学者利用酵母和哺乳动物双杂交系统从随机组合表达文库中分离得到了一个新的肽适配子Id1/3-PA7，它能与Id1和Id3特异地相互作用。从而抑制Id1和Id3对E47蛋白的截留，激活E-box启动子，上调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CDKN1A和CDKN1B)的表达，所以说肽适配子Id1/3-PA7能够诱导乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231细胞周期阻滞和凋亡。它可能是一种无毒的外源性药物，可显著刺激乳腺癌细胞的抗增殖和凋亡效应，这与Id1和ID3的表达失控有关。ID蛋白的过度表达，常见于包括乳腺癌在内的几种人类恶性肿瘤中。它的过度表达及其在肿瘤发生、肿瘤侵袭、转移和新血管生成中的作用使其成为抗癌治疗的有吸引力的靶点，此研究将可能是治疗乳腺癌和其他癌症的一种新策略。

雌激素受体(ER)约在 70%的乳腺癌患者中会出现高表达，从而导致预后不良。这是因为 ER 的高表达增加细胞分裂引起突变，破坏细胞周期，最终导致肿瘤的发生。雌激素反应元件(ERE)，它是雌二醇靶基因启动子中的一段 DNA短序列，与雌激素-ER 复合物有高亲和力。何煦，陈杰等人采用指数富集的配体系统进化技(SELEX)从 ERE 寡核苷酸池中筛选出一段与乳腺癌细胞株 MCF-7(表达ER)作为 ER 核酸适配体[3]，通过体外实验证明，它能够抑制体外乳腺癌细胞的增殖。目前治疗乳腺癌辅助药物有很多，但是有很多结果显示这些药物长期使用会导致耐药。通过核酸适配体抑制乳腺癌细胞增殖，进而成为乳腺癌患者的一种治疗手段。 而且它对人正常乳腺上皮细胞没有任何毒副作用。

2 与肺癌相关的核酸适配体

肺癌是位于恶性肿瘤死亡之榜首，对人类的身体健康产生了很多的威胁。肺癌包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌，肺癌是中国近年来癌症死亡的首要原因[4]。大约有80%的肺癌患者被诊断为非小细胞肺癌(NSCLC)，其中化疗仍然是非小细胞肺癌的主要治疗手段。

肺癌干细胞(CSCs)影响非小细胞肺癌的预后，所以消除肺CSCs可以提高药物对肺癌的治疗效果，CD133抗原是实体肿瘤(包括肺癌)中可能的CSCs标记物，Jun 等人制备一种新型的CD133适配子修饰的DTX脂质体系统，并对其体内外特性进行研究，发现CD133-DTX LP的DTX释放相对较慢，这是因为CD133适配子的存在可能会阻碍药物的释放。在此研究中，研究表明CD133适配子修饰DTX LP可显著抑制细胞增殖，提高治疗效果，体内显像结果也表明CD133-DTX LP具有很好的肿瘤靶向性。此研究中研究者可以发现核酸适配体在肺癌治疗中起着很重要的作用。

半乳糖凝集素-1(Gal-1)是一种β-半乳糖苷结合蛋白，参与肿瘤的发生发展过程。它能够参与肿瘤免疫逃逸，诱导细胞凋亡，Yao-T等人证明一种新型的Gal-1靶向DNA适配子AP-74M-545，其与Gal-1高亲和力结合。通过实验表明，Gal-1适配子通过阻断Gal-1和CD45之间的相互作用而抑制肿瘤生长，从而从凋亡中拯救T细胞，恢复T细胞介导的免疫。这些结果表明AP-74M-545可能是一种潜在的肿瘤免疫治疗策略。因此研究出具有高特异性适配体是肿瘤治疗的关键。

3 与肝癌相关的核酸适配体

肝癌是目前世界上第三大致命癌症，世界上半数以上肝细胞癌发生在我国，中青年居多。肝癌发病机制复杂，发病快，然而没有比较有效的治疗方法。最主要问题是，大多数癌症都是在晚期诊断出来的，手术切除已经不可行了。 肝癌筛查方法主要依赖于测量血清R-胎儿蛋白(AFP)的水平，这是一种生物标志物，以及超声成像。AFP的敏感度和特异度非常有限。此外，在癌症发展的早期阶段，即治疗最有效的阶段，甲胎蛋白并不总是升高，有30%左右肝癌患者的 AFP水平并不升高，最新肝癌诊治指南已经不再强调联合 AFP 检测的重要性，而且影像学只能提供有限的形态学信息。因此要达到早期诊断的目的，必须有分子探针能够识别的癌症特异性生物标志物[5]。

Di等人应用了一种新开发的细胞-SELEX(指数富集配体的系统进化)方法来产生特异性识别肝癌细胞的分子探针，在识别适配子的过程中，使用了两个肝癌细胞系：肝癌细胞系BNL 1ME A.7R.1(Mear)和非肿瘤细胞系BNL C1.2(BNL)。两种细胞系均来源于Balb/CJ小鼠。BNL细胞系是来自同一只小鼠的成对细胞系，这两个细胞系有不同的生物学表型，一个是癌细胞系，另一个不是，其中BNL作为对照组。鉴定出来一组适体，识别出特定的癌细胞特异性适配子，那就是TLS9a和TLS11a，它们能够特异性地识别Kd在纳摩尔范围内的癌细胞系Mear，最终还评估了这两种适配子治疗人肝癌的可能性。事实上通过选定的适体可以去探索疾病的分子本质，从而获得更多的信息，也为疾病的治疗也提供了帮助。

丙型肝炎病毒感染是一个世界性的健康问题，可导致慢性肝炎、肝硬化和原发性肝癌。病毒NS3丝氨酸蛋白酶除了在病毒多蛋白加工中发挥作用外，还参与与多种细胞之间的相互作用，还会导致恶性转化。目前NS3被认为是抗病毒药物的主要靶点。为了抑制NS3蛋白酶活性作为抑制HCV复制的手段，Meital等人采用了一种新的细菌遗传筛选方法来分离NS3抑制肽适配子进行研究，结论显示肽适配子在体外对NS3蛋白酶活性有抑制作用，IC50在低微摩尔范围内，它有望成为干扰HCV生命周期和致病性的一种很有前途的抗病毒方法。

4 与前列腺癌相关的核酸适配体

前列腺癌是指发生在前列腺的一种上皮性恶性肿瘤。前列腺癌的诊断主要依靠直肠指诊、前列腺肿瘤细胞表面抗原PSA、经直肠前列腺超声和盆腔MRI检查，PSMA被认为是一种很好的前列腺肿瘤细胞标志物。血清PSA测定高于4.0 ng/mL的临界值通常被认为是阳性的，PSMA的表达主要是前列腺特异的，在大脑、唾液腺和小肠中的表达水平非常低。但是由于PSA灵敏度有限，因此为了做到更加准确的诊断，我们探索并创建核酸酶稳定的RNA适配子来结合和抑制前列腺肿瘤细胞表面抗原PSMA的酶活性。 Shawn E.等人研究鉴定出来两个人工合成的寡核苷酸(适配子)，它们被分别命名为xPSM-A9和xPSM-A10[6]，它们是从最初的40mer文库中挑选出来的，该文库由61014个随机序列RNA分子组成，目的是为了它们能够与代表PSMA胞外706个氨基酸的重组蛋白(称为xPSM)结合，这些适配子的高亲和力通过它们抑制PSMANAALADase活性的能力来证明，相信在未来会有更多的PSMA适配子用来进一步研究，来评估它们作为前列腺癌诊断和治疗药物的前景。

5 展望

核酸适配体的优势在于其广阔的前景和诸多优点，如适配体的特异性、选择性，能够识别目标癌细胞，减少对正常细胞的损伤。其缺乏免疫原性，可降低免疫反应。许多适配子(如IgE，IFN-g)亦可作为治疗靶点[7]。而且它们足够大，可以与生物聚合物靶标紧密而特异地结合，与传统药物相比，似乎更难对它们产生抗药性。但是仍然还有许多问题需要解决：①它用SELEX筛选耗费时间长，目前被筛选出来的核酸适配体仍然非常少，所以需要研究出更多种类的核酸适配体；②它与靶点的结合，限制了检测的灵敏(1)通过体外SELEX方法选择的核酸适配体可能无法在体内穿过屏障，也无法有效识别体内特定的肿瘤蛋白质，会使治疗效果不好。解决办法就是将实验动物作为靶标，这样得到的核酸适配体会具有更好的靶向特异性及稳定性[8]。(2)核酸适配体的治疗性化合物是针对一种单一的耐药机制，难以完全克服肿瘤的多药耐药性肿瘤性。改进方法是对给药系统进行不断完善。(4)如一些限制核酸适配体技术，因为它的独家专利也影响着核酸适配体的发展。目前核酸适配体还不及抗体应用范围广，其仍在不断的研究中，因此进一步在各种肿瘤疾病中对核酸适配体进行更广泛的研究，需要业内专家不断的努力。相信随着相关技术的不断进步，越来越多不同的核酸适配体将被筛选出来，这对疾病的早期诊断与治疗具有重要意义。