塞内卡病毒A VP1基因原核表达及蛋白纯化

贺大芳，邱文英，陈奕帆，邹 瑶，王 德

（华派生物工程集团有限公司，四川 简阳 641402）

猪塞内卡病毒A（Senecavirus A,SVA）易感染动物。猪是该病毒的重要传染源，能通过多种途径排出病毒，如唾液、粪便、水疱皮等，在康复的动物组织中也能检测到该病毒核糖核酸[1]。SVA可引起猪出现水疱性变化和新生仔猪死亡，成年猪通常呈亚临床感染，引起繁殖母猪和公猪鼻吻和冠状带、蹄部出现水疱样病变，偶见腹泻症状[2]。SVA易感动物较广泛，不仅不同年龄猪均易感[3]，研究者还在其他动物如人、苍蝇[4]、牛和鼠等的血清中发现了SVA中和抗体，表明SVA能感染的动物种类可能较多。SVA能适应不同的细胞系，可利用猪睾丸细胞（SK-RST）、猪肾细胞（PK-15）和幼仓鼠肾细胞（BHK-21）[5]、人肺癌细胞（NCI-H1299）[6]等对SVA进行分离。

SVA是小RNA病毒，是塞内卡病毒属（Senecavirus）的唯一成员[7]。它的基因组全长为7.2 kb，包括5'非编码区、一个开放阅读框及3'非编码区，其功能如同mRNA，编码病毒聚蛋白。SVA颗粒呈典型的二十面体对称，直径27 nm左右，外表面点缀着VP1、VP2和VP3伸出的肽环，且VP1和VP3是主要的抗原表位[8]。其中，VP1是能够显著诱导细胞发生早期和晚期凋亡，并且能够促进凋亡蛋白Caspase3、Caspase8及Bax蛋白和mRNA水平的上调[9]，且VP1核苷酸易发生变异[10]，是抗原变异的关键结构蛋白，因此VP1是重要的抗原位点。

因此，本研究以SVAVP1基因为目的片段构建的原核表达载体在大肠杆菌中进行了诱导表达，并经过纯化获得较高纯度的蛋白，为后续SVAVP1蛋白免疫原性的研究及塞内卡病毒病抗体ELISA方法的建立奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

SVAVP1基因序列[参考GenBank中收录的SVA-001（DQ641257）的基因组序列VP1基因]，大小为788 bp，由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成；pET-28a（+）载体由本实验室（华派生物工程集团质检研发中心）保存；SVA高免血清由本实验室自制。

1.2 主要试剂

E.coli DH5α和BL21（DE3）感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司；T4连接酶、限制性内切酶Bam HI和Xho I购自宝生物工程（大连）有限公司；2×Taq Mix、质粒小提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；HRP标记的山羊抗猪IgG抗体购自KPL公司。

1.3 试验方法

1.3.1 VP1基因的扩增 参考GenBank中收录的SVA-001（DQ641257）的基因组序列的VP1基因合成的序列为目的片段，并以此序列片段为模板设计1对引物，正向引物加入Bam HI酶切位点，F:5'-CGCGGATCC TACCGTGAAACTCGGGCTATTACCA-3'；反向引物加入Xho I酶切位点R:5'-CCGCTCGAGAAGCTTGGAA GCGCCCCCCCA-3'，加下划线部分即为引入的酶切序列，引物的合成由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。以合成的VP1基因序列为模板进行PCR扩增，反应体系为：2×Taq Mix 12.5μL，dNTPMix 1.0μL，上下游引物各1.0μL，模板2.0μL，ddH2O补足至25μL。PCR反应程序为：94℃5min，（94℃30 s，53℃45 s，72℃1min）35个循环，72℃10min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.3.2 重组质粒的构建 利用胶回收试剂盒将VP1基因扩增片段纯化回收，利用Bam HI和Xho I进行双酶切，同时用Bam HI和Xho I双酶切pET-28a（+）载体，酶切结束电泳后切胶回收。两种酶切产物按照适宜比例，利用T4连接酶在16℃过夜连接，连接产物经热击法转化至E.coli DH5α感受态细胞，涂布含卡那霉素的平板，37℃过夜培养，挑取单个菌落进行菌落PCR鉴定。鉴定呈阳性的菌落经扩大培养后，质粒小提试剂盒提取质粒，再进行Bam HI和Xho I双酶切鉴定，酶切鉴定正确的克隆送成都擎科梓熙生物技术有限公司进行测序验证，测序验证正确的重组质粒命名pET-28a（+）-VP1。

1.3.3 重组质粒pET-28a（+）-VP1的诱导表达 取成功构建的pET-28a（+）-VP1重组质粒转化至E.coli BL21（DE3）感受态细胞，涂布于含卡那霉素抗性的LB平板，37℃过夜培养。分别挑取3～5个单菌落于含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，37℃、180 r/min培养12～16 h，以此为种子液。种子液按照体积比1∶100转接到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，当菌液的D600值在0.8～1.0时，加入终浓度为1 mmoL/L的IPTG，在37℃、180 r/min进行诱导表达，诱导6 h。诱导后菌液经4℃、5 000 r/min离心收集菌体。菌体用PBS缓冲液重悬后冰浴超声破碎，裂解液进行离心后分别收集上清和沉淀，对其进行SDS-PAGE凝胶电泳检测，上样量为15μL，考马斯亮蓝染色后分析重组VP1蛋白表达情况。

1.3.4 重组VP1蛋白的纯化及复性 经小量表达验证成功的克隆，扩大培养后进行大量诱导，收集大量诱导表达菌体后，用PBS缓冲液重悬，冰浴超声破碎，离心收集包涵体沉淀。包涵体沉淀经包涵体洗涤液洗涤后用8M尿素溶解，再4℃、12 000 r/min离心25 min。上清液移至处理后的透析袋中，依次经6M、4M、2M、1M、0.5M、0.2M尿素透析复性。纯化的每个步骤后都进行SDS-PAGE电泳，分析纯化后重组蛋白的纯度和表达量。

1.3.5 纯化后VP1蛋白Western blot鉴定 取纯化复性后的VP1蛋白，经SDS-PAGE分离后，转移至PVDF膜，用含50 g/L脱脂奶粉溶液的PBST常温封闭2 h；加入SVA高免血清（1∶2 000稀释），4℃孵育过夜；TBST洗涤3次后加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG（1∶50 000稀释），室温孵育2 h；TBST洗涤3次后ECL显影。

2 结果

2.1 VP1基因的PCR扩增

经PCR法扩增出788 bp的VP1基因序列，扩增产物大小与预期相符（图1），表明本研究成功克隆到SVAVP1基因。

2.2 原核表达载体的构建与验证

将VP1的PCR产物和载体pET-28a（+）分别用限制性内切酶Bam HI和Xho I进行双酶切，酶切产物经T4连接酶连接，热击转化至DH5α感受态细胞中。挑取菌落PCR验证为阳性的单菌落（图2），提取的重组质粒经双酶切验证（图3）后送生物公司经载体pET-28a（+）的T7-Terminal引物测序。测序结果表明该序列与GenBank中收录的SVA-001（DQ641257）的基因组序列的VP1基因序列的相似性为100%，且编码框插入正确。

2.3 重组VP1基因的原核表达及可溶性分析

利用鉴定为阳性的BL21（DE3）/pET-28a（+）-VP1原核表达菌株进行原核诱导表达，加入终浓度为1 mmol/L IPTG，37℃下诱导表达6 h。菌体经过离心重悬，超声破碎后进行SDS-PAGE电泳。结果（图4）：BL21（DE3）/pET-28a（+）-VP1菌成功表达出预期36 kDa大小的特异性蛋白条带，且超声裂解后菌液及离心后的上清液和沉淀的电泳结果表明，表达的VP1蛋白主要以包涵体形式存在。

2.4 VP1蛋白的纯化

将超声波裂解后的菌液沉淀用包涵体洗涤液洗涤3次后，用8M尿素溶解可得到纯度较高的VP1蛋白（图5）。再依次经6M、4M、2M、1M、0.5M、0.2M尿素进行透析复性，得到纯度为80%以上、浓度为400μg/mL的VP1蛋白。

2.5 纯化后VP1蛋白Western blot分析

Western blot检测结果表明，纯化后的VP1蛋白可与SVA高免血清发生特异性结合，出现一条大小与SDS-PAGE中VP1蛋白一致的条带（图6），表明该条带为VP1蛋白。

3 讨论

近几十年来关于SVA大量研究发现，SVA已发生变异，致病性逐渐增强[11]。并且VP1基因也表现出明显差异，但这些变异是不是导致毒株致病性增强的原因还有待研究。有研究表明，诱导机体产生中和抗体的抗原具有构象依赖性[12]，因此VP1蛋白空间构象与其功能有着重要联系。作为SVA最重要的结构蛋白，VP1蛋白在病毒感染和自然免疫中都发挥着重要作用[13]，故而获得有活性的高质量的VP1蛋白对于进一步研究SVA诊断及其防治显得尤为重要。

大肠杆菌表达系统能表达外源蛋白，具有方法简单、蛋白表达量高、蛋白易纯化、成本低等优点，胰岛素等生物制品都能在大肠杆菌中表达，其中以BL21（DE3）为应用最广泛的表达宿主。pET系列的载体采用噬菌体T7启动子，目的基因克隆到载体上，可以实现目的基因的高效表达，但目标蛋白主要以包涵体形式表达[14]。包涵体是没有生物活性的蛋白，是蛋白表达过程中肽链部分折叠的中间体聚合形成的，其复性效率较低，除了与复性过程性质相关外，还与蛋白质本身特性有关。

目前关于SVA的研究主要是流行病学、临床症状和病原学等方面，其诊断技术主要集中在病原学诊断和血清学诊断，其防治技术仍处于探索阶段。因此，本试验起以pET-28a（+）为表达载体，构建了重组质粒pET-28a（+）-VP1并于原核表达系统BL21（DE3）表达了重组蛋白，以为后续VP1蛋白的功能研究、SVA诊断方法研究以及疫苗的开发奠定基础。本研究结果显示，VP1蛋白主要以包涵体的形式进行表达，与各文献报道一致。本试验经洗涤，尿素溶解及复性过程得到了高纯度的VP1蛋白，为后续研究奠定了基础。