不同地方猪种背部皮下脂肪中m iR-206差异表达研究

陶 璇，顾以韧，杨雪梅，梁 艳，何志平，钟志君，杨跃奎，曾 凯，陈晓晖，王 言，龚建军，应三成，吕学斌

（四川省畜牧科学研究院动物遗传育种四川省重点实验室，四川 成都 610066）

miRNA是一类长度约为22个核苷酸的内源性非编码单链RNA，通过结合靶基因mRNA的3′UTR，降解靶miRNA或阻止蛋白质翻译，在转录后负调控基因的表达，是基因表达的重要调控因子，在细胞增殖、分化、发育、代谢、凋亡和肿瘤转移等多种生物学过程中起着重要作用[1]。近年来研究发现，miRNAs与猪脂肪细胞的生长、分化和增殖密切相关[2]。其中，miR-206主要参与细胞生长、增殖、凋亡以及细胞迁移等的调控，是肌肉特异表达的miR-1家族成员之一，早期的研究表明，miR-206参与肌肉的生成[3]，近年来发现miR-206与多种肿瘤的发生发展密切相关，可作为一种肿瘤抑制基因[4]；但miR-206与脂肪细胞的分化、增殖相关的研究还未见报道。

鉴于此，本试验以四川省6个地方猪种丫杈猪、内江猪、成华猪、青峪猪、雅南猪、藏猪为研究对象，采用荧光定量PCR技术检测miR-206在不同猪种背部皮下脂肪中的表达差异情况，为进一步探明不同猪种脂肪沉积能力及肉质差异形成的分子机制提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2015年4—10月在四川省畜牧科学研究院种猪科研基地进行。6个四川省地方猪种包括丫杈猪、内江猪、青峪猪、雅南猪、成华猪、藏猪，每个猪种随机选取3头健康断奶仔猪（30日龄），共计18头，同一时间开始组建群体，相同品种同栏饲养，采用相同营养水平和饲喂方式，达到6月龄进行屠宰，屠宰前停食24 h，自由饮水。屠宰后迅速采集倒数3～4肋骨间对应处的背部皮下脂肪组织。

1.2总RNA提取和QRT-PCR

脂肪组织的RNA按照miRNeasy Mini Kit(Qiagen,China)的操作说明书提取，QRT-PCR采用miScriptⅡRT Kit（Qiagen，China）根据操作说明将RNA转录成cDNA，采用miScript SYBR®Green PCR Kit（Qiagen，China）在CFX96 Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad，USA）仪器上进行荧光定量检测，每个反应体系20μL。以5S、18S和U6作为荧光定量PCR的内参基因，引物信息见表1。所有目的mRNA定量结果均通过熔解曲线分析验证PCR产物的特异性，确保产物无引物二聚体，每个样本重复3次，每次检测含3个阴性对照。采用2-ΔΔCt法计算目的miRNA的相对表达量。

表1 引物信息

1.3 数据统计分析

运用GeNorm软件计算看家基因的归一化因子NF（Normalization factor）值，以目的基因的拷贝数与对应样本的NF值的比值表示基因的相对表达量。采用SigmaPlot 12.5软件对性状指标和基因相对表达量进行统计分析（ANOVA），结果以“平均数±标准差”表示。

2 结果与分析

由表2可知，藏猪miR-206相对表达量最高，成华猪次之，青峪猪最低；藏猪miR-206相对表达量显著高于内江猪（P＜0.05），极显著高于丫杈猪和青峪猪（P＜0.01）。

表2 不同猪种背部皮下脂肪miR-206相对表达量

3 讨论

脂肪组织不仅是动物机体能量储存的一种形式，还参与调节包括食欲和能量消耗等多个机体功能，对繁殖、炎症和免疫反应等多个复杂的生理过程也有重要调控作用[5]。此外，脂肪还是影响猪经济价值和肉质风味的重要因素[6-7]。因此，研究猪的脂肪代谢不仅有利于改善胴体和肉质性能，还有助于推动人类肥胖和代谢性疾病的研究。

为探明猪脂肪沉积性状相关基因或调控因子差异表达的分子遗传机理，近年来育种学家已在猪脂肪沉积的调控机理方面做了大量研究[8-9]，但这些研究主要集中在DNA和mRNA水平的编码基因，随着miRNA的发现和功能研究的深入，从转录后的miRNA水平探索猪脂肪沉积形成的分子机理成为了研究的热点[2]，但相关报道仍然较少。研究发现，miR-193b、miR-365、miR-196a、miR-133a/b、miR-455在棕色脂肪形成中有重要作用[10-11]，miR-128也可通过靶向基因抑制前体脂肪细胞的增殖和分化[12-14]。Wang等[15]研究发现，miR-206在1日龄荣昌猪背部皮下脂肪组织中高表达，之后30、90、240日龄表达水平急剧下降。

本试验对四川省6个地方猪种背部皮下脂肪中miR-206的表达差异情况进行了研究，研究结果可为进一步探明miRNA在猪脂肪沉积中的作用提供参考。