无菌动物在宿主肠道菌群研究中的应用*

2020-02-18马思彦王俊平董丽娜赵仲华

实验动物科学 2020年2期

马思彦王俊平董丽娜赵仲华

(1.山西医科大学，太原 030012)(2.山西医科大学附属人民医院消化内科，太原 030012)(3.山西医科大学附属人民医院中心实验室，太原 030012)(4.山西大学生物医学研究院，太原 030012)

通常实验动物按照对微生物和寄生虫控制程度分为无菌动物(GF)、悉生动物(GN)、无特定病原体动物(SPF)和普通级动物(CR)[1]。无菌动物是在其体内检测不出任何生命体，包括细菌、病毒、真菌、原生生物和寄生虫等[2]。由于无菌动物体内没有任何微生物，因此可通过接种特定的一种或几种微生物来控制动物体内微生物群的存在。应用无菌动物模型研究宿主肠道微生物，很大程度上避免了因宿主本身携带的微生物对实验结果造成的影响,可提高实验的准确度、灵敏度和可重复性。

1 无菌动物种类

1.1 无菌斑马鱼

1942年，Baker等首次报道了无菌鱼类的研究[3]。近年来，相对于小鼠模型遗传操作和治疗药物规模筛选等繁琐的方法，斑马鱼以其独特的解剖生理特点成为生命科学研究的新对象。斑马鱼(zebrafish) 是一种杂食性淡水硬骨鱼，广泛用于发育生物学、生理学、遗传学、毒理学以及生殖生物学的研究[4-6]。其体外受精、胚胎透明、胚胎发育同步且周期短、与哺乳动物肠道相似的组织和功能以及肠道易于取样、测量等特点[7]，使其成为研究肠道微生物的理想动物模型。宿主与微生物相互作用的许多方面只能在整个生物体内进行研究，斑马鱼作为一种模式生物，在感染生物学和共生微生物与宿主相互作用的研究中起到了很大的作用[8]。

1.2 无菌鼠

小鼠在解剖、细胞生理及基因组同源性上与人类高度相似、且便于管理操作，因而被作为经典的动物模型得到广泛应用[9]，并且人体肠道菌群一旦在无菌小鼠体内成功定植, 就可以维持很长一段时间[10]。与小鼠相比，大鼠体型大、各项器官功能基本稳定、生理学特征易于研究、且认知行为等方面与人类更接近，是多种疾病的重要模式动物。

1.3 无菌鸡

有研究表明，鸡作为无菌动物模型，不仅其饲养过程简单，进化史及成长背景清楚，并且其在孵化之前就能判断其父母代是否达无菌状态[11]。

1.4 无菌猪

无菌猪在解剖、生理、生物化学、遗传及营养代谢等方面与人类高度相似, 且相对于无菌小鼠可更加精确地用于肠道菌群与人类健康关系的研究[12]，因此，无菌猪模型被认为是生物医学研究与开发中的重要的转化动物模型[13]。应用无菌猪构建动物模型，目前已在畜牧生产、生物学、免疫性疾病、食品营养、生物制剂[14-15]等方面显示出广泛的应用前景。

2 无菌动物模型的构建

无菌动物作为研究肠道菌群最适的动物模型，其建立需依赖完整的无菌培养系统，包括隔离器、传递窗、恒温加热装置、照明灯、紫外杀菌灯和空气过滤装置等[9]。并且动物的饲养、实验等操作均需在严格无菌条件下进行。

2.1 无菌斑马鱼

参照单颖等[9]的方法构建无菌斑马鱼模型，取成年斑马鱼1～2对放入新鲜过滤水中，隔离雌、雄鱼。次日更换新鲜过滤水，让其自然产卵。立即收集鱼卵并用一次性灭菌吸管将受精卵转移至无菌培养皿中。经无菌培养液清洗卵3次后加入适量无菌培养液，放入无菌培养隔离器，每12 h更换一次无菌液，直至标本生长发育至实验标准，然后用一次性灭菌吸管采集斑马鱼周围环境、斑马鱼体及胚胎培养液样本，放入各种培养基中适宜温度培养，涂片染色，检测有无微生物的存在，明确是否符合无菌动物模型的要求。

2.2 无菌鼠

1959年成功培育出第一只无菌小鼠[2]。按照Al-Asmakh等[16]的方法，构建无菌小鼠模型需保证小鼠胎儿期在母体内即是无菌的。无菌剖腹摘除小鼠子宫囊，消毒后放置于无菌隔离器中，然后将囊内的幼体转移至无菌鼠体内，之后在无菌隔离器内生长，经数代繁殖之后才可培育出无菌小鼠。无菌大鼠的培育主要由无菌剖腹产获得，首先建立SD大鼠群，使其交配产生子代，子代由无菌剖宫取出至无菌隔离器中饲养，饲料、水一律要求严格无菌，特制灌胃器的使用有助于无菌大鼠哺乳成功[17]，最终检测其生长环境及大鼠是否达到无菌动物的标准。

2.3 无菌鸡

选取SPF(无特定病原体)鸡蛋，无菌操作放入无菌孵化器中孵化，孵化的子代在无菌隔离器中饲养，饲料均经高压蒸汽消毒后经隔离器传递仓对接送入。待动物生长到实验要求的月龄数，检查肠道(粪便)内有无细菌存在，无病原微生物即无菌动物模型建立成功。

2.4 无菌猪

1895年柏林大学培育出世界上第一批无菌猪，这些无菌猪仅存活了13 d[16]。1960年Landy等[18]在无菌隔离装置基础上构建了无菌实验室,通过子宫切除术获得无菌猪。

3 GF动物在肠道菌群中的研究应用

3.1 肠道菌群对机体生长发育的影响

动物肠道的生长发育直接影响宿主的生长和健康状况，肠道微生物菌群的建立显示了肠道菌群可能参与宿主肠道的发育[19]。在斑马鱼模型中，肠道微生物会影响机体的生长发育以及上皮再生和肠细胞形态[20]，若缺乏肠道微生物，幼鱼肠的分化会停滞在某特定阶段，同时引起其功能的改变，但此时引入微生物群落后，该现象可被逆转[21-22]。Yossa 等[4]通过在鱼饮食中添加抗生素抑制肠道微生物的生长来建立模型，发现斑马鱼出现生长减慢，死亡率升高等现象。肠道菌群还可影响肠道黏膜形态，Awad 等[23]通过实验对比，在饲粮中添加益生菌，可显著增加35日龄肉鸡空肠和回肠的绒毛高度。此外，无菌鼠和普通鼠相比，肝、肾组织的蛋白表达水平均有显著变化，免疫系统也存在一定差异[16,24]。根据肠-脑轴学说，微生物还被证明可以调节大脑的功能和发育。如，在无菌小鼠的大脑中观察到前额叶皮层神经元的髓鞘增生及无菌小鼠杏仁核和海马神经元的树突在形态学上不同于对照组等[25]，无菌小鼠的大脑表达有缺陷的小胶质细胞，在微生物群落恢复到控制水平后，小胶质细胞被部分拯救[26]。最近的一项研究中发现，无菌小鼠体内接种与生长相关的婴儿微生物群可影响神经元和少突胶质细胞的发育[27]。

3.2 对器官功能的影响

微生物菌群的存在可能影响器官的发育，进而改善功能。相比普通级小鼠，无菌鼠的肝脏体积和肠道总质量更小，肠道固有层和结肠壁更薄，更为突出的是无菌鼠有巨大的盲肠[16]。酒精过量摄入可诱发无菌小鼠更加严重的肝脏损伤和更加明显的肝脂肪变性[28]。Semova 等[29]研究发现，正常斑马鱼较无菌斑马鱼脂肪酸的吸收更多，且无菌动物肠道黏膜细胞具有较低的代谢更新率，而微生物群落可维持消化道的功能[20,22]。

3.3 单菌的功能

Neely等[30]使用不同的链球菌感染斑马鱼，包括化脓链球菌与海豚链球菌，获得了细菌半数致死量和斑马鱼存活曲线等数据。Davis等[31]建立了海豚分枝杆菌感染斑马鱼的方法，造成肉芽肿病灶模型，并发现斑马鱼因感染途径和接种剂量的不同引发了不同程度的病变。有报道[32]无菌小鼠体内接种多形拟杆菌及史氏甲烷短杆菌时，果聚糖的发酵增加，杆菌的代谢产物增多，从而改善宿主的肠道功能。

3.4 与疾病的关系

Lee等[33]比较了无菌条件下饲养的小鼠与常规条件下饲养的小鼠后发现，实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)明显减弱。许多研究表明帕金森病的微生物群发生了改变[34-36]。Yano等[37]发现一个由20种产芽孢细菌组成的微生物组可以增加无菌小鼠机体血清素的产生水平,而这种外周血清素的水平和多种疾病的发生有关,如肠易激综合征、心血管疾病等。最近一项针对首发精神疾病的研究，其中发现乳酸菌和双歧杆菌的流行率与健康年龄匹配的对照组相比有所降低[38]。同时，动物模型也提示了肠道微生物在焦虑和创伤相关疾病中的作用[39]。

3.5 影响菌群的因素

Zeng等[40]以无菌小鼠为基础构建人源菌群(HFA) 动物模型，发现肠道双歧杆菌计数随年龄增长而增加，而乳酸杆菌计数随年龄增长而减少，表明年龄和应变影响HFA小鼠模型中的肠道微生物区系。

3.6 研究趋势

斑马鱼作为一种重要的脊椎动物模型，在药物筛选与遗传研究方面具有独特的优势。用无菌小鼠研究约氏乳杆菌、长双歧杆菌及大肠杆菌的动态变化及相互作用，结果提示细菌间的相互作用系统可能为研究复杂微生态系统基本规律提供基本法则[41]。Suárez等[42]研究发现，无菌小鼠机体中存在高水平的特定细胞因子,而抑制这种特殊信号或许会损伤抗生素诱导的皮下脂肪褐变过程、抑制肠道菌群剔除小鼠的葡萄糖表型,有助于开发治疗肥胖等疾病的新型疗法。与小鼠和人相比，小型猪具有丰富的上皮内γδT细胞，较高数量的γδT细胞受体能够建立有效模型用于研究这些细胞如何快速地作用于肠道细菌抗原[13]。肠道菌群相关的健康研究以及潜在的器官移植供体仍是无菌猪作为模型动物的发展趋势和研究方向，从而为动物和人类健康提供认识和治疗疾病的基础。

3.7 目前存在的问题

就现有的研究成果看，鼠模型中仍存一些问题：①小鼠独特的生理、解剖结构和行为(如吞咽)难免会影响微生物群落。②在人体中没有发现几种在小鼠肠道中定居的细菌[9]。③无菌小鼠属于啮齿类动物, 与人体还存在非常大的差异, 用无菌小鼠模型模拟人体肠道菌群受到质疑[12]，因此在应用于人类时可能受限。在构建无菌大鼠的模型中，动物的喂养、食物的成分等也是造模的关键及面临的问题。相对于小鼠模型，斑马鱼仍存在与人类亲疏关系较远，技术手段相对积累少等问题。由于品种不同，猪的大小和特征可能存在很大差异，同时，饲养时间、条件、食物的选择都是无菌猪、无菌鸡需考虑的问题。