糖尿病肾病动物模型研究进展*

田 雄 郑敬民

(浙江省台州医院，台州 317000)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病主要的慢性并发症之一，也是导致终末期肾病的主要原因。DN临床早期表现为肾小球滤过率减少，后期出现蛋白尿增多、动脉血压升高和体液潴留，最终导致肾衰竭，并出现尿毒症等症状，严重危害人类健康。控制血糖及血压能够减缓糖尿病患者向终末期肾病转化，但目前临床上尚缺乏新的治疗方法医治糖尿病肾病[1-2]，其最根本的原因是对糖尿病肾病的发病机制尚未完全阐明。建立适当的动物模型，可以为研究DN的病因、发病机制和病理生理改变提供重要的线索，同时也为临床治疗DN提供理论依据[3]。糖尿病并发症联盟及动物模型肾病小组委员会(AMDCC)基于人类DN的临床和病理特征，概括了以下关于DN的啮齿动物模型的验证标准：(1)肾脏功能退化50%；(2)蛋白尿增加10倍以上；(3)病理特征包括血管基质扩张(+/结节)，肾小球基底膜增厚，小动脉透明质和管状纤维化[4]。一个理想的糖尿病肾病模型应该符合所有这些标准。然而，目前的各类动物模型并未完全满足以上标准，无法理想地复制出人类DN，这也解释了诸多在临床前期试验中有益的疗法，在临床应用中被证明无效的原因[5]。因此，寻找并构建能真实模拟人类DN主要特征的动物模型，仍然是未来有意义的研究方向。本文将现有DN模型加以综述，比较其优缺点，以期未来能复制出理想的DN动物模型，为DN的防治和研究提供有效的途径。

1 诱发性DN动物模型

诱发性模型相比于自发性动物及转基因动物模型，成本低廉，操作方便，应用比较广泛常见的有化学药物诱导、高糖高脂饮食诱导以及化学药物和高脂饮食联合诱导、化学药物联合手术等手段[6]。

1.1 化学药物诱导DN模型

最早的化学药物诱导的 DN 模型是由Naccarator等[7]在1964年使用四氧嘧啶诱导建立。目前该类模型最常见的是由链脲佐菌素(STZ)、四氧嘧啶(ATX)作为主要药物诱导而成。STZ和ATX对胰岛细胞有很强的选择性杀伤作用,其中 STZ通过影响葡萄糖激酶的功能，诱导DNA双链的断裂，高特异性杀伤胰岛β细胞，使细胞内胰岛素合成受损，导致胰岛素分泌缺乏。STZ应用较为广泛，适用于多种大小鼠模型且DN模型制备时间短，但此类模型肾脏病变比较温和，而且STZ本身的非特异性毒性会干扰实验结果判断[8]。

造模方法：最常用的使用SD及Wistar大鼠，小鼠作为造模对象也有相关报道。STZ腹腔注射剂量为50～75 mg/kg体质量，病程为4～24周。动物从4周开始出现肾脏早期病变，系膜基质扩张，基底膜增厚。随病程延长，后期可出现肾间质小血管玻璃样变等肾小管及间质病理改变，模型鼠尿蛋白排泄率增加[9]。

1.2 合并性诱导DN模型

为加快肾脏病理变化，缩短实验周期，不同研究者对原有单一药物诱导的DN模型加以改进，结合单侧或部分肾切除、高糖高脂诱导等手段，加速糖尿病肾病进展。

Melissa等[10]在DN相对耐受的C57Bl/6 (B6)小鼠中，利用STZ结合单侧肾切除术，成功地建立了Ⅰ型糖尿病肾病模型。研究人员对6周龄C57BL6/J 小鼠行左侧肾切除术后，每只小鼠隔日注射50 mg/kg STZ，共3次。12周后，与对照组相比，模型组小鼠血糖水平差异显著，24 h蛋白尿明显增加；模型组小鼠肾小球肥大且损伤严重，肾小球系膜基质扩张， TGF-β1、cTGF、Collagen IV等纤维化标志物的表达水平明显升高。

2 自发性动物模型

自发性动物模型是没有经过任何人为干预，在自然情况下由于基因突变或染色体畸变等发生的DN模型。相比于诱导模型，自发性模型在一定程度上减少了人为因素，其发病原理及特征更切近人类DN。但此类模型种类有限，疾病动物饲养条件要求高，发病率低，病程长，价格较高[11]。

2.1 NOD (non-obese diabetic mouse)小鼠

NOD小鼠来源于ICR小鼠，它通过自身免疫系统破坏胰岛细胞，小鼠胰腺在4～5周自发出现不同程度的炎症反应，到24～30周龄时多数胰腺β细胞遭到破坏出现糖尿病，37周龄时NOD小鼠可发展为DN，主要表现为蛋白尿增加、肾脏病理学变化、系膜细胞增生、肾小球毛细血管基底膜增厚、细胞外基质增多、最后出现肾小球硬化[12]。

2.2 胰岛素-2 Akita小鼠

此小鼠在Ins2(C96Y)中有一个突变，导致胰岛素2 A、B链间无法正确地形成二硫键，导致胰岛素构象发生剧烈的变化，同时对胰腺β细胞产生蛋白毒性，导致β细胞团减少，分泌胰岛素的能力减弱。4周龄Akita小鼠就出现明显的高血糖症、高水平的白蛋白尿以及持续的组织学变化。另外，Akita小鼠还会出现高血压及心脏衰竭等糖尿病并发症[13]。

2.3 KK-Ay 小鼠

这种小鼠最早由日本学者近藤恭司和西村正彦将Ay基因导入KK小鼠体内建立。与KK小鼠相比，KK-Ay 小鼠早期会出现重度肥胖及高血糖，且模型小鼠肾脏损伤与人类2型糖尿病肾脏损伤非常相似，可作为2型糖尿病模型动物。因KK-Ay 小鼠体毛呈黄色，也有人称其为yellow KK[14]。Ito等[15]报道了 KK-Ay小鼠肾小球的病理变化与人类DN早期阶段的病理变化一致。该研究发现，KK-Ay小鼠的尿蛋白/肌酐比率明显高于非糖尿病的BALB/c小鼠，其HbA1c的含量也明显高于BALB/c小鼠(p<0.001)。AS和酸-甲胺银染色结果表明，20周龄KK-Ay小鼠的肾小球中发生节段性硬化，而且AGEs和TGF-β定位在肾小球系膜区。

2.4 BB大鼠

此种大鼠是由Wistar大鼠经筛选而得，可作为自身免疫性胰岛素依赖性糖尿病动物模型，其肾脏病理改变较轻微且周期较长，18个月才出现肾小球基底膜增厚，系膜容量增加。而尿蛋白及白蛋白排泄没有出现明显的改变，GFR却明显增加[16]。

3 基因工程小鼠模型

基因工程小鼠遗传背景清晰，造模时间短。利用基因工程技术，可以便利地在动物基因组特定位点引入突变基因或将某一基因敲除，以此研究特定基因在动物发生与发育过程中的作用。但由于人类DN的发病机制和遗传决定因素的阐述尚不完善，将相关的基因或遗传变异纳入模型，不能完全真实地反映人类DN。

3.1 eNOS 敲除鼠

在db/db小鼠中，eNOS基因敲除会导致高血压和内皮功能障碍，并加速肾脏的损伤，可表现为早发性蛋白尿、小动脉透明质化以及肾小球滤过率下降50%。26周后其病理改变表现为肾小球系膜基质扩张、伴小动脉瘤的肾小球系膜溶解及kimmelstiel-wilson 结节性改变[17-18]。

3.2 OVE26小鼠

在FVB背景下，OVE26小鼠2月龄时出现蛋白尿，9月龄时表现出肾小球结节性硬化，并且蛋白尿增加了十倍。OVE26小鼠单侧肾切除会促使多种DN特征包括蛋白尿、炎细胞浸润、纤维化和基因表达的变化的产生[19]。

3.3 转基因mRen-2大鼠

Kelly等[20]将小鼠Ren2基因转入SD大鼠基因组，并观察血管紧张素在糖尿病肾病发生发展中的作用。研究人员利用 STZ 诱导TG(mRen-2)27 大鼠成糖尿病后，其生物活性肾素大量增加，导致肾脏血流动力学发生改变，进而损伤肾脏；同时 TGF-β1表达增加，加重肾纤维化。

Betz和Conway[21]利用低剂量吲哚-3-甲醇处理mRen-2大鼠诱发中度高血压。在没有高血压的情况下，STZ诱导的糖尿病大鼠蛋白尿增加了14倍，但只出现轻微的组织学和基因表达变化。在高血压刺激下，高血糖导致糖尿病大鼠白蛋白尿增加了500倍，肾小球硬化和肾小管间质纤维化程度加重。

4 加重DN模型

化学药物诱导和基因工程手段并不能完全概括人类的DN特征。将糖尿病易感模型与其他致病基因相结合，能够加重模型鼠病理学病变及肾脏损伤程度[22-25]。

4.1 BTBR ob/ob小鼠

Hudkins等[26]对BTBR背景小鼠进行了ob/ob 瘦素突变，这些小鼠8周时出现明显的高血糖症状，蛋白尿升高，肾小球系膜基质积累，20周时肾小球出现与晚期DN相似的病变。22周时，基底膜厚度增加约20%，系膜基质增加约50%。弥漫性系膜硬化(局部趋近结节性肾小球硬化)，局灶性小动脉玻璃样变性，血管溶解，局灶性轻度间质纤维化。

4.2 MKR小鼠

Mallipattu等[27]构建的小鼠骨骼肌中的胰岛素样生长因子受体(IGF-1R)功能缺失鼠，即为MKR小鼠。这些小鼠体型偏瘦，存在明显的胰岛素抵抗、高胰岛素血症、高血糖和血脂异常，因此可作为非肥胖人类Ⅱ型糖尿病动物模型。糖尿病MKR小鼠表现出明显的蛋白尿和肾小球损伤。24周的高脂饲料喂养会显著增加MKR小鼠蛋白尿以及病理学改变包括肾小管扩张、显著的足细胞减少和GBM增厚。

4.3 OVE26-TTRhRen双转基因小鼠

Thibodeau等[28]将STZ注射到TTRhRen转基因小鼠中，发现其蛋白尿显著增加和肾脏病理学明显改变，而且其肾脏病变速度快于OVE26转基因鼠。OVE26-TTRhRen 双转基因小鼠的白蛋白尿增加了40倍，并伴有更严重的组织病理学损伤，包括肾小球硬化和间质纤维化。在这些小鼠中，GFR在12～20周剧下降。

5 讨论

随着对DN动物模型研究的不断深入，一些较为理想的动物模型也已建立，并在糖尿病肾病的分子机制研究中发挥了重要作用。但是，由于人类DN发病的复杂性以及实验动物与人类DN的差异性，现有的动物模型无法完全满足AMDCC肾病小组委员会关于理想DN模型的标准和完全重现人类DN疾病[29]。目前，化学诱导动物模型只能简单地模拟早期人类肾病模型；自发性动物模型虽然可以较形象地模拟人类DN, 但其培养困难，造价高昂；基因工程小鼠遗传背景清晰，造模时间短、成模效果较好，但大多数基因工程小鼠与人类DN仍然存在一定的差距；而将致病基因与易感模型鼠结合可以快速地建立糖尿病肾病模型，其中一些模型表现出人类DN的基本特征包括高水平的白蛋白尿、结节性肾小球硬化和高血压，这可能是未来糖尿病肾病动物模型的发展方向。

新的DN动物模型制备不仅需要描述实验动物肾脏功能和病理变化，还应该探究其相关因子转录水平的变化是否与人类疾病相关。模型动物能真实地模拟和反映人类DN相似的肾脏病理生理学变化，是人类糖尿病肾病研究的重要基础。此外，将系统生物学、基因组学及代谢组学研究方法结合起来，不断完善模型制备技术并增强DN复杂病因的转化研究，有助于模拟出更接近人类DN的动物模型。因此，未来结合不同技术手段，从发病机制着手构建与人类DN发病病因、病程及病理相似的动物模型，依旧是今后糖尿病肾病领域的研究重点。