微生物菌种选育中基因组重排技术应用的研究进展

王珂佳1,2,3,邱树毅

(1.贵州轻工职业技术学院轻工化工系,贵州贵阳 550025; 2.贵州省发酵工程与生物制药重点实验室,贵州贵阳 550025; 3.贵州大学生命科学学院,贵州贵阳 550025; 4.贵州大学酿酒与食品工学院,贵州贵阳 550025)

微生物菌种是发酵工业发展的关键因素之一。在食品、医药、环保等诸多领域,菌种质量优劣直接决定了其发酵过程成败和发酵产品质量的高低。目前,常用的微生物菌种选育方法主要有以自然选育、诱变育种、杂交育种为代表的传统育种[1]和以原生质体融合、基因组重排技术、转基因技术等为代表的基因工程育种[2-4]。传统育种因不用掌握微生物及其次生代谢产物的遗传信息而操作简单,但育种时间长,工作量大,突变效率低[5];利用基因技术虽然能够以定向和组合方式在目的菌种特定基因组位置上进行修饰[6],但因需对目的菌种的基因信息全面准确掌握,在一定程度上限制了基因工程育种技术的应用推广[1]。

20世纪90年代末期,基于传统诱变技术和细胞融合技术的基因组重排(genome shuffling)概念首次被提出[7],2002年,Zhang等[8]以传统诱变方法获得的多种正突变子为出发菌株,通过多轮递推原生质体融合使基因组随机重排筛选出性状最优的后代菌株。基因组重排技术具有操作简单、突变效率高和适用性强等特点,是一种新型的微生物菌种选育方法,同时,因为重排后的菌株不被认为是转基因生物,所以该技术被广泛应用于食品、医药工业生产[9]。本文对近年来基因组重排技术在微生物育种领域的应用研究进展进行了详细阐述。

1 基因组重排技术的原理

基因组重排技术是一种基于诱变技术和原生质体融合技术相结合经改良的菌株选育技术。常规原生质体融合技术是指两个细胞之间融合的过程具有不同的遗传特性,并结合双亲的遗传特性获得稳定的重组体。在原生质体融合过程中,每代只有两个亲本产生重组。基因组重排技术虽然起源于原生质体融合,但是与原生质体融合相比,基因组重排技术允许经诱变技术处理产生的多个正突变菌种之间进行重组,并且通过几轮递归基因组融合,导致最终改进的菌株涉及来自多个正突变菌株的遗传性状,极大增加了“复杂后代”的遗传多样性,并显著提高获得高性能菌株的机会[10]。

2 基因组重排育种操作过程

采用基因组重排技术对微生物菌种进行选育主要包括构建有效亲本文库,制备原生质体,递归原生质体融合和筛选优质突变菌株等步骤[11]。

2.1 诱导构建有效亲本文库

构建具有强效菌株的有效亲本文库是基因组重排的第一步。在构建亲本文库时,初始微生物群体必须具有良好的遗传多样性和足够的表型变异,然后使用甲基硝基亚硝基胍(N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine,MNNG)和甲基磺酸乙酯(Ethyl methylsulfonate,EMS)等化学诱变剂[9]或紫外线、辐射等物理诱变剂[11]对菌株进行单轮或数轮诱变。有时,为了使菌株产生更高水平的多样性,也可以组合使用诱变剂[12]。近年来有研究表明,常压室温等离子体(Atmospheric and Room Temperature Plasma,ARTP)中的活性粒子可以有效造成微生物DNA多样性的损伤,且突变率高,获得的突变株遗传性状稳定,是一种操作简便,经济性好的诱变技术[13]。最后,性状表现最佳的菌株被鉴定为递归原生质体融合的下一步的亲本。

2.2 原生质体制备

原生质体是根据微生物的类型,运用适合的溶酶体,裂解酶或其他细胞消化酶消化剥离细胞壁来释放原生质体[11]。原生质体制备作为一个酶解过程,酶的性质、用量、酶解时间、温度和pH等都是制备高质量原生质体的影响因素[14]。汪军玲等[15]研究发现菌龄5 d的1%纤维素酶比果胶酶和溶壁酶更有利于北冬虫夏草原生质体的形成和释放,且最优酶解时间为2 h。Inoue等[16]在35 ℃下利用海藻酸裂解酶和β-1,4-内切葡聚糖酶可高效制备日本海带原生质体,最适pH分别为8.7和5.9。陈建中[17]选择培养60 h的草菇菌丝,在溶壁酶浓度1.5%,32 ℃条件下酶解3 h,以0.6 mol/L甘露醇为渗透压稳定剂有效制备了草菇原生质体。通过选择适合的酶,优化酶的用量、酶解时间、温度和pH等因素可以有效制备高质量原生质体。

2.3 递归原生质体融合

递归原生质体融合是基因组重排的关键步骤,通过突破种属间界限来扩大基因组重排的范畴和多样性。首先,将通过酶解微生物细胞所获得的原生质体进行离心收集,然后,通过电脉冲或硝酸盐、聚乙二醇等化学试剂[10]改善膜的流动性来实现原生质体融合,刘红全等[18]通过对经诱变处理的拟微绿球藻(Nannochloropsisoculata)进行两轮递归式原生质体融合,筛选到遗传稳定、脂肪酸产量提高的改组藻株。胡向东等[19]经过4轮原生质体递归融合从绿色产色链霉菌(Streptomycesviridoehrongenes2-21)突变株中筛选出1株遗传稳定的高产阿维拉霉素重组菌株H4-15。近年来,光学镊子[20]、飞秒激光[21]和微流体芯片[22]等新技术也被应用于原生质体融合。最后,在融合结束时将获得的原生质融合体离心,洗涤,重悬于缓冲液中,连续稀释并在再生培养基上再生获得的菌株并进行下一轮融合,重复几轮直至获得所需的菌株[9]。原生质体融合的效率受工艺条件的影响,因此,在进行原生质体融合之前,需要优化融合条件,以确保高效率的原生质体融合和再生[23]。严寒静等[24]在研究广藿香原生质体制备中以40% PEG 6000化学促融30 min、加入0.5倍体积的融合液、细胞密度2.0×105个·mL-1的条件进行原生质体融合,融合率可达57.19%;李亮等[25]采用基因组重排法选育高产洛伐他汀红曲菌株时,发现原生质体融合最佳条件为30% PEG,0.03 mol·L-1Ca2+,30 ℃融合12 min,原生质体融合率提升1.95%,说明通过优化融合条件,可有效提高原生质体的融合率。

2.4 优质突变菌株筛选

建立一种高通量的筛选优质突变菌株的方法是保障基因组重排成功育种的关键。在筛选改善胁迫耐受性或底物利用菌株时,常用的筛选方法主要有维多利亚蓝板测定(Victoria Blue Plate Assay)[26],含有氯化钠的酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(Yeast extract peptone dextrose media containing sodium chloride)[27]和含有木糖,乙醇和琼脂的选择性培养基(Selective media containing xylose,ethanol and agar)[23]等的筛选方法,通过观察培养基上菌株的透明区,水解区和抑制区等生长特征来评估性状。另外,筛选能提高次生代谢产物产量的菌株,主要应用实时定量聚合酶链式反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)[13]、荧光定量(Fluorescent quantitation)、逆转录聚合酶链式反应(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)[28]和毛细管区带电泳(Capillary zone electrophoresis)[29]等基于生长的高通量筛选方法。筛选出的突变菌株,还需通过性能和遗传稳定性等方面的综合评价,才能被确定为满足工业生产需要的改良菌种[30]。胡向东等[19]以利福平为筛选剂,通过基因组重排,从绿色产色链霉菌(Streptomycesviridoehrongenes2-21)中筛选出1株遗传稳定的高产阿维拉霉素重组菌株H4-15。赵晨等[31]以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)转酮酶缺陷变异株为出发菌株,通过反向筛选标记法构建获得一株具有正反向筛选标记的菌株,再经基因组重排筛选高抗逆性D-核糖高产菌株。宋佳雯等[32]通过基因组重排,经过96孔板发酵高通量筛选和摇瓶发酵复筛验证,获得了一株产谷氨酰胺转胺酶(TGase)达7.12 U/mL的茂源链霉菌。赵俊杰等[33]利用巴龙霉素抗性筛选和基因组重排技术选育出一株ε-聚赖氨酸高产菌株。目前,基因组重排技术已被有效应用于优质突变菌株筛选。

3 基因组重排技术在微生物菌种选育中的应用

基因组重排技术是一种快速有效定向进化细胞基因组的方法,在微生物领域,该技术被广泛应用于生产改良菌株,在增加次生代谢产物产量、增强菌株耐受性和提高底物利用能力等方面具有显著作用。

3.1 基因组重排技术增加微生物代谢产物产量

微生物是生产氨基酸、抗生素、抗肿瘤化合物、免疫抑制剂、抗病毒剂、抗寄生虫药和酶制剂等生物制品的重要来源。大多数生物制品的性状表型是依赖于遗传水平上的多个协调变化而产生的,通过传统的随机诱变方法改良基因表型需要筛选大量复杂的基因组合文库,才能成功分离出所需表型。基因组重排技术是一种快速改进微生物菌株表型的方法。Zhang等[8]首次利用该技术改良泰乐菌素产生菌,结果表明仅在2轮基因组改组后便获得了显着的表型改善,而传统诱变筛选则需要20多年的时间。目前,基因组重排技术已被广泛应用于细菌、霉菌、酵母菌和放线菌等多种微生物菌种改良以获得高产量的生物制品。

在改组细菌研究方面,Zhang等[34]利用基因组重排方法,构建了一株高产γ-聚谷氨酸(γ-gamma-PGA,γ-PGA)的耐葡萄糖枯草芽孢杆菌菌株(High glucose tolerant Bacillus subtilis)。首先通过紫外诱变对母本枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)W14株进行定向进化,然后进行三轮基因组重排,最终筛选出一株高性能枯草芽孢杆菌C2。该菌株生长48 h后能产生(45.6±0.7) g/L的γ-聚谷氨酸(γ-PGA),比母体W14菌株提高了3.5倍;菌体浓度比母体W14菌株提高了2.3倍,达到(15.3±0.5) g/L。SHI等[35]利用基因组重排原理对淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)LZ-5产脂肽类抗生素性状进行了改良,经过两次基因组重排,获得了一株179.22 mg/L的伊枯草菌素A(iturin A)高产菌株,比野生菌株增产2.03倍。Zhao等[36]利用基因组重排技术,经过两轮基因组重排提高了淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)ES-2-4产泛革素(Fengycin)能力,获得一株高产重组FMB72菌株,产量增加了8.30倍。

在改组酵母菌研究方面,Yin等[12]应用基因组重排技术提高了酿酒酵母YS86产谷胱甘肽的产量,经过2轮基因组重排获得了一株高产重组YSF2-19菌株,其谷胱甘肽的产量32倍。为提高阿拉伯糖醇的生产能力,Kordowska等[37]对假丝酵母(Candida parapsilosis)进行基因组重排育种研究,初始菌株通过紫外辐射诱变,经二轮基因组重排筛选出两种融合子GSII-3和GSII-16,两种融合子在选择培养过程中产生的阿拉伯糖醇浓度比野生型菌株高50%,均能产生11.83 g/L和11.75 g/L的阿拉伯糖醇,且比野生型菌株的效率高出15%～16%,且经测定新菌株的倍性没有改变,说明基因组重排技术具有遗传安全性。

在改组霉菌研究方面,El-gendy等[28]在对海洋红树林源真菌进行洛伐他汀产量筛选时,以米糠固态发酵(solid state fermentation,SSF)的方式,以卢氏曲霉(Aspergillusluchuensis)MERV10为亲本菌株,通过诱导突变和连续3轮基因组重排,优化米糠固态发酵(SSF)因子,使洛伐他汀(Lovastatin)的产量提高了32倍。Wang等[38]利用基因组重排技术,利用特异性原生质体融合技术成功培育出具有高果糖转移酶(FTase)活性的米曲霉(Aspergillusoryzae)菌株,其果糖转移酶(FTase)活性约为原菌株的2倍。

在改组放线菌研究方面,Wang等[30]结合基因组重排和庆大霉素抵抗来提高了蛋白链霉菌(Streptomycesalbulus)W-156中的多聚赖氨酸(Epsilon-poly-l-lysine,epsilon-PL)的产量。Yu等[39]采用基因组重排和核糖体工程相结合的方法,获得了玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)的PRGN21突变体,该菌株产生的达托霉素产量接近324 mg/L,是亲本菌株产量的4倍。Tong 等利用基因组重排技术对弗吉尼亚链霉菌(Streptomycesvirginiae)进行改良,经过5轮基因组重排,获得了一株基因稳定的菌株G5-103,其特征是能产生251 mg/L的威里霉素(Virginiamycin),是野生株的11.6倍[40]。

综上所述,基因组重排技术在改进细菌、酵母菌、霉菌和放线菌等微生物菌株表型上具有显著效果。

3.2 基因组重排技术增强微生物对环境耐受性

微生物对环境耐受性主要包括对代谢产物、底物、副产物的耐受性和对温度、pH和溶剂等工艺环境因素的耐受性。由于微生物的许多耐受表型是多基因相互协同作用的结果,因此,对于其环境耐受性的研究是一个复杂且困难的过程。近年来,相关研究表明,基因组重排技术在改善微生物的环境耐受性方面表现出巨大优势。

在生物乙醇发酵的最后阶段,高浓度的乙醇会导致酵母细胞发酵缓慢或停滞,并限制乙醇的生产,因此在现代生物乙醇生产工艺中要求酿酒酵母具有耐热性、渗透性和对次生代谢产物的抗性增强等特点[41],但迄今为止,在自然界中还没有发现具有上述所有特征的菌株。近年来,开发具有良好乙醇耐受性的新型酿酒酵母菌株提高产量和效率成为了研究的热点。Snoek等[42]基于基因组重排原理,通过几轮机器人辅助的靶向基因组重排,选育出的耐乙醇杂交酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌种表现出较高的耐乙醇性和产量。Wei等[43]基于基因组重排技术建立了一种提高醋酸细菌(Acetic acid bacterium)乙醇耐受性的方法。以野生型醋酸菌为材料,经诱变处理后,通过3轮基因组重排筛选出一株耐乙醇菌株,该菌株可以在含13%乙醇的液体培养基中生长。De gerando等[44]采用随机诱变和基因组重排技术,提高了厌氧拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)DSM 6423对异丙醇的耐受性,突变菌株对异丙醇的耐受浓度高达50 g/L。酵母发酵过程中产生的大量乙醛会影响产品质量。

亚硫酸盐废液(Spent sulfite liquor,SSL)是亚硫酸盐制浆过程中产生的一种废液,其中含有可发酵成乙醇的单糖。然而,酿酒酵母会受到亚硫酸盐废液(SSL)中抑制物质的影响,降低乙醇产率。为了克服这一局限性,Pinel 等[45-46]采用基于大规模群体杂交的基因组重排技术对酿酒酵母进行了定向进化改造,使其对硬木亚硫酸盐废液(Hardwood spent sulfite liquor,HWSSL)具有比野生型更强的耐受性。通过紫外光诱导酿酒酵母突变,经过5轮基因组重排,分离出3株能够在未稀释的硬木亚硫酸盐废液(HWSSL)上生长的菌株,并能利用其中的单糖高效生产乙醇。Bajwa等[47]为了提高毕赤酵母对硬木亚硫酸盐废液(HWSSL)的耐受性,采用紫外光诱导起始菌株,进行4轮基因组重排后获得4个突变株,其对硬木亚硫酸盐废液(HWSSL)的耐受性提高至80%(v/v)以上,而起始菌株则在65%(v/v)或更低。

3.3 基因组重排技术提高微生物对底物的吸收利用能力

有效利用发酵底物也是微生物的一个重要表型特征,通过基因组重排技术可以提高微生物利用底物的能力。Kang等[48]利用基因组重排技术对出芽短梗霉菌(Aureobasidiumpullulans)N3.387进行改良,经3轮基因组重排后获得的突变体F3-2的原料利用率为97.9%,比野生型菌株高29.0%。2012年,Ge等[49]利用基因组重排改良酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae),经过3轮基因组重排,获得了一株发酵木糖和葡萄糖的基因稳定、产乙醇高的菌株。该菌种发酵84h后,产乙醇26.65 g/L,比酿酒酵母W5(18.12 g/L)产乙醇高47.08%。木糖和葡萄糖的利用率分别为69.48%和100%,而W5的利用率分别为14.83%和100%。Ren等[50]采用基因组重排技术,结合耐高温酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和念珠菌(Candidaintermedia)中间体23的葡萄糖-乙醇和木糖-单细胞蛋白的优良特性,构建了酿酒酵母重组菌株14。以NaOH预处理和玉米秸秆为原料,采用补料分批发酵工艺生产乙醇和单细胞蛋白,为农业生物质中己糖和戊糖的综合利用提供了可能的途径。Inokuma等[51]利用抗药性标记辅助基因组重排技术建立了一种利用酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株在高温和酸性共胁迫下提高木糖发酵能力的方法,提升了酿酒酵母利用木糖发酵的能力。与亲本菌株相比,杂交菌株在热、酸共胁迫条件下均表现出较高的木糖发酵能力。Demeke等[52]利用基因组重排技术,将木糖代谢途径结合到工业酵母菌株乙醇红(Ethanol red)中开发出一种能利用木质纤维素水解产物生产生物乙醇的菌株。

4 展望

基因组重排技术(genome shuffling)自1998年首次提出以来,已成功应用于大量细菌、霉菌、酵母菌和放线菌等具有不同工业价值的微生物菌种选育,为微生物性状改造提供了一条高效、简便、省时省力的途径。近年来,虽然对基因组重排技术进行了广泛研究,但该技术还存在以下几个方面的问题。第一,构建有效亲本文库是基因组重排的第一步,目前常用的构建方式多数是传统的化学诱变和物理诱变。但是传统诱变技术存在突变方向和性质不能控制,正向变异少,须大量材料等缺点。虽然近年有文献报道常压室温等离子体(ARTP)[53-55]因其价廉简便、突变率高、环境友好等特点被用于菌种诱变,但常压室温等离子体(ARTP)诱变机制还未阐明[56],突变方向难以控制的局限性也未能突破。因此在构建有效亲本文库技术上还需要进一步的研究。第二,基因组重排的关键步骤是实现原生质体有效融合,虽然光学镊子[20]、飞秒激光[21]和微流体芯片[22]等新技术的出现,实现了原生质体的高效融合,但上述技术作为新兴技术自身还存在一定缺陷,其稳定性、有效性和适用性还需要提高。第三,利用基因组重排技术改良菌株实现增加次生代谢产物产量、增强菌株耐受性和提高底物利用能力等方面的研究还处于定性定量阶段,对于产生上述效果的作用机制研究还不够深入。第四,筛选优质突变菌株是基因组重排的最终目的。基因组重排后快速有效地从大量融合体中鉴定所需表型是非常困难的,需要建立一种能广泛应用的高通量筛选方法。

随着代谢组学、蛋白组学、基因编辑技术和生物信息学等现代生物工程理论和技术的蓬勃发展,有利于结合相关理论和技术改良优化基因组重排技术,提高其在微生物菌种选育方面的应用效率,为食品、医药、环保等产业培育出更多高效优质功能菌种。