自噬与HMGB1在糖尿病视网膜微血管病变和神经退行性变中的研究进展△

冯路迦 张学东

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是与持续性高血糖相关的一种慢性、进行性、潜在危害视力的视网膜疾病[1]。在西方国家，DR是工作年龄人群(20～64岁)失明的主要原因[2]。在我国，随着糖尿病发病率的增加，DR的患病率以及由DR引起的失明率也逐年上升。以往认为，DR是一种微血管病变，事实上，近年美国糖尿病协会(American Diabetes Association,ADA)已经将DR定义为一种高度组织特异性的神经血管并发症[3]。但目前关于DR

的发病机制尚不明确，研究认为其可能与多元醇代谢通路异常、蛋白质非酶糖基化产物堆积、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的活化、血管紧张素转换酶系统的作用等相关[4]。而近年研究发现，自噬与高迁移率族蛋白B1(high mobility group box protein 1，HMGB1)存在于病理性新生血管生成和神经退行性变中，并以此参与DR的发生发展[5-6]。

1 自噬与糖尿病视网膜微血管病变和神经退行性变

细胞自噬是广泛存在于真核细胞内的一种溶酶体依赖的降解途径，胞内受损的蛋白质和细胞器通过自噬作用被降解，产生的氨基酸、脂肪酸等降解产物再被细胞重新利用。自噬主要包括3种形式：巨自噬、小自噬和分子伴侣介导的自噬，通常所说的自噬是指巨自噬(本文所指为巨自噬，以下简称自噬)。自噬过程主要包括自噬体的形成、自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体以及自噬溶酶体通过蛋白水解酶降解吞噬的物质。自噬过程的任何一个环节受损都将导致自噬功能障碍[7]。自噬现象贯穿于真核细胞正常生长增殖和病理生理过程，对细胞作用具有双重性。自噬对细胞作用的双重性根据疾病进展的不同阶段、细胞微环境的变化和治疗干预措施等不同而产生不同的生理效应。比如在生理状态或某些疾病初期，自噬有助于清除衰老细胞以及清除受损的细胞或细胞器，而在自噬功能过强时则对细胞或组织、器官产生致病作用[8-9]。

1.1 自噬与糖尿病视网膜微血管病变DR是血管内持续性高糖状态诱发的视网膜微血管病变[10]。大量研究表明，自噬功能受到抑制会促进微血管循环障碍。Müller细胞是视网膜上分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)最多的细胞。将小鼠视网膜Müller细胞置于高糖环境中，发现高糖使Müller细胞自噬功能受到抑制，导致大量VEGF释放，在使用自噬激动剂雷帕霉素以后，VEGF释放明显减少；同时，在动物模型中得到了类似的结论[11]。在对视网膜新生血管形成进行研究的过程中发现，高糖可以激活视网膜血管内皮细胞自噬相关因子的表达，从而抑制VEGF的释放，最终抑制视网膜新生血管形成[12]。然而，最近也有研究表明，自噬功能异常激活可能促进VEGF的表达。体外实验证明高糖可导致内皮细胞内自噬通量的异常增高，增高的自噬通量会对血管内皮细胞产生损伤，诱导血管内皮细胞凋亡。这一病理过程可被自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)抑制[13]，表明自噬的异常激活是高糖状态下血管内皮细胞损伤的原因之一。这证实了自噬对于细胞的作用具有双重性，适度的细胞自噬可以维持细胞内环境的稳定，高糖环境所导致的自噬信号过度激活或者激活减弱，都将促进糖尿病视网膜微血管病变的发生。

关于自噬异常促进糖尿病视网膜微血管病变发生的机制还有待进一步研究，但在对高糖环境下的鼠Müller细胞进行研究发现，高糖可以导致细胞内内质网应激增强，使细胞内未折叠蛋白增加，同时细胞内溶酶体酶活性降低，自噬活性减弱，从而使大量的自噬底物泛素化p62堆积，最终导致大量VEGF释放以及细胞凋亡[11]。此外，在对视网膜新生血管形成进行研究中发现，Sirtuin 3(Sirt3,一种主要的线粒体NAD+依赖性脱乙酰酶)通过抑制自噬相关因子的表达，抑制视网膜新生血管形成[12]。Fu等[14]发现，腺苷5’-单磷酸活化蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate activated protein kinase,AMPK)通路的激活可能参与了高糖所导致的自噬功能异常，并导致大量VEGF的释放。

1.2 自噬与糖尿病视网膜神经退行性变研究已经证实视网膜神经退行性变是DR的早期改变，近期研究表明，细胞自噬与糖尿病神经退行性变息息相关[15]。大量研究表明，自噬的激活与糖尿病神经退行性变呈正相关。对糖尿病小鼠模型进行研究发现，在出现视网膜血管损伤和细胞凋亡以前，就已经出现了自噬功能紊乱和视杆细胞损伤。同时在该模型中还发现，通过激活自噬，小鼠视网膜细胞凋亡增加，从而使视网膜外核层(outer nuclear layer,ONL)变薄，在促进硫氧还蛋白(Trx)表达以后，自噬活性受到抑制，减少了细胞凋亡，同时也阻止了ONL变薄[16]。在将人Müller细胞暴露于糖化-低密度脂蛋白(glycated low density lipoprotein cholesterol,HOG-LDL)中发现，HOG-LDL表现出明显的毒性作用，诱导细胞自噬并显著降低细胞活力，使细胞凋亡和神经胶质细胞活化增加。小檗碱抑制细胞自噬并显著增加细胞活力，减少细胞凋亡和神经胶质细胞活化[14]。然而，也有研究表明，自噬的激活与糖尿病视网膜神经退行性变呈负相关。研究表明，神经保护因子可以通过抑制mTOR活性来促进自噬，从而起到保护细胞的作用[17]。

目前认为，关于自噬异常促进糖尿病视网膜神经退行性变发生的机制可能与高糖导致大量的晚期糖基化终末产物(advanced glycation end-products,AGEs)积累、Trx表达降低以及AMPK通路的异常激活有关，但更深入的分子机制还有待进一步研究[16]。Ankita等[18]发现糖尿病患者体内血清离子钙增加可以诱导视网膜光感受器细胞凋亡，导致视网膜光感受器椭球区(ellipsoidzone,EZ)破坏增加，从而促进DR。

这些研究表明，在糖尿病情况下，自噬对视网膜细胞的作用具有双重性，也许正如Fu等[19]发现的那样，在轻度氧化应激条件下，自噬对细胞起保护作用，但在氧化应激增加到一定程度时，自噬将促进糖尿病视网膜微血管病变和神经退行性变的发生。因此推测，维持自噬功能的正常可能阻止DR的发展。

2 HMGB1与糖尿病视网膜微血管病变和神经退行性变

HMGB1因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳时的快速迁移而得名，主要存在于细胞核，其广泛分布于脑、心、肝、淋巴以及肾等组织中。HMGB1由3个独特结构域组成：带负电荷的C-末端区(天门冬氨酸和谷氨酸)、带正电荷的N-末端的A盒和B盒，后两者为同源性的 DNA结合序列，在细胞外，B-box是引起炎症反应的功能结构域，致炎区域存在高度保守的B盒DNA结合区，而A盒对B盒具有一定的拮抗作用[20]。细胞核内的HMGB1从细胞核转移到细胞质以后，主要参与炎症的激活、自噬的调节以及细胞凋亡的调控；而细胞外的HMGB1则作为危险预警分子，将危险信号传递给相邻的细胞[21-22]。

2.1 HMGB1与糖尿病视网膜微血管病变近年来，HMGB1被视作一种直接或间接的促血管生长因子，它可以通过激活巨噬细胞而导致后者分泌更多的VEGF[23]。研究发现，DR患者玻璃体中的HMGB1、VEGF、内皮细胞血管生成标志物可溶性血管内皮钙黏蛋白(sVE-cadherin)和可溶内皮糖蛋白(sEng)水平显著高于非糖尿病患者，并且HMGB1和sVE-cadherin水平之间存在显著正相关[24]。最近发现，DR模型在缺血缺氧条件下，视网膜色素细胞中的HMGB1在细胞内重新定位，并且大量的HMGB1释放到细胞质中，使视网膜色素细胞中血管纤维化因子表达上调，并促进DR的发生；相反，阻断HMGB1的激活可以预防病理性新生血管的发生[25]。

Chen等[26]发现，HMGB1这些促血管生成的作用可能是通过激活核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)，并与TLR4结合，从而参与糖尿病视网膜微血管病变；Gong等[27]发现，HMGB1可以通过直接导致视网膜血管周细胞和血管内皮损伤以及死亡来促进DR的发生；Mohammad等[28]发现，在糖尿病大鼠模型中，HMGB1表达增加，并激活了转录激活因子-3，从而导致Müller细胞释放大量的VEGF，并使得视网膜血管内皮细胞迁移能力增强。

2.2 HMGB1与糖尿病视网膜神经退行性变越来越多的研究表明，HMGB1参与到糖尿病视网膜神经退行性变中。研究发现，在DR早期，HMGB1可以通过下调对视网膜具有保护作用的脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)的表达，抑制BDNF对视网膜的保护作用，从而导致视网膜神经退行性变[29]。在糖尿病大鼠和正常大鼠玻璃体内注射HMGB1都将诱导视网膜上的 HMGB1表达增加，从而使突触素、酪氨酸羟化酶、谷氨酰胺合成酶和乙二醛酶-1表达明显下调[30]。Elaskar等[31]在DR患者玻璃体和糖尿病大鼠动物模型中发现，HMGB1表达升高，并伴随谷氨酸、突触体素、酪氨酸羟化酶、谷氨酰胺合成酶以及乙二醛1的显著下调。这表明HMGB1 参与到早期糖尿病视网膜神经退行性变中。

关于HMGB1 参与到早期糖尿病视网膜神经退行性变的机制，Zhao等[32]认为，HMGB1可能是通过激活HMGB-1-TLR4-NF-κB信号转导途径，激活炎症，促进RGC凋亡，从而促进糖尿病视网膜神经退行性变；Jiang等[33]发现，HMGB1可能是通过激活HMGB1-TLR9信号参与到该疾病过程中的；Elasrar等[31]发现HMGB1通过活化的信号调节激酶(EPK1/2)、活化型半胱天冬酶-3 和谷氨酸盐途径参与到早期糖尿病视网膜神经退行性变中。

这些研究均提示，HMGB1可能成为阻止糖尿病视网膜微血管病变和神经退行性变进程或者治疗的一个潜在的靶点。

3 自噬与HMGB1的相互作用

HMGB1和自噬在DR中均可能扮演了关键角色，但是在DR中有关二者之间究竟是否存在一定联系以及存在何种联系尚未见报道。不过在糖尿病以及其他疾病中有大量研究表明HMGB1与自噬有着密切关系。

研究表明，HMGB1可能作为自噬激活分子发挥其作用，而自噬同样也可以调控HMGB1的生成、分泌和降解。一方面，在细胞核中，HMGB1通过调节热休克蛋白HSPB1/HSP27来调控自噬；在细胞质中，HMGB1能够与BCL2竞争性结合Beclin1来激活自噬反应；而在细胞外还原型的HMGB1 能与其受体RAGE1 结合，同样能活化自噬信号[21]。另一方面，在细胞受到外界刺激时，自噬可以通过ROS-依赖的途径促进HMGB1由细胞核移位到细胞质，从而取代 Bcl-2 而与 Beclin1 结合，激活自噬反应并进一步维持自噬，在使用自噬激动剂雷帕霉素以后，分泌到细胞外的HMGB1也是增加的，同样的在使用了自噬抑制剂3-MA以后，分泌到细胞外的HMGB1也受到了抑制[34]。HMGB1可以通过自噬-溶酶体途径进入溶酶体，从而被降解。而进入溶酶体内的HMGB1可以使溶酶体膜通透性增加，从而使自噬途径的重要成员溶酶体酶B从溶酶体中释放到细胞质中，诱发炎症反应并引起细胞凋亡[35]。同时，有研究表明，溶酶体酶B也可以调控HMGB1的释放，在细胞受到外界刺激时，尤其是饥饿、氧化应激、感染等，会导致细胞自噬-溶酶体途径受到损害，导致溶酶体膜通透性增强，使大量溶酶体酶B从溶酶体中释放到细胞质，从而引起大量HMGB1释放，维持炎症反应及细胞凋亡[36]。此外，HMGB1与NF-κB关系密切，HMGB1可以影响 NF-κB 的激活，从而影响炎症的发生[37]。而自噬与 NF-κB关系也非常密切，二者不仅拥有共同的上游调控信号，并且通过自噬途径可以抑制 NF-κB 的激活，限制炎症的发生[38]。在分子水平，自噬与NF-κB通过正负反馈彼此影响，来维持细胞内的稳定[39]。因此，自噬可能通过NF-κB通路与HMGB1途径产生对话。

4 小结

综上所述，细胞自噬与HMGB1 在糖尿病视网膜微血管病变和神经退行性变中均发挥了重要作用，推测在 HMGB1 刺激下可诱导视网膜细胞发生自噬现象，而自噬也可以影响HMGB1的表达。尽管目前对于自噬与HMGB1在DR中所起的作用进行了一些研究，但没有深入探讨自噬功能障碍及HMGB1表达异常和诱导损伤的病理机制，因此其致病机制还有待进一步探究。通过干预自噬或HMGB1相关靶点，探究其在DR发病中的分子机制，对于DR 的防治具有重要的理论意义和临床应用价值。