东北刺人参抗疲劳及改善睡眠节律作用研究

王艳艳,翟春梅,申柯欣,米 晓,黄莉莉,孟永海,李廷利

(黑龙江中医药大学药学院,黑龙江哈尔滨 150040)

东北刺人参(OplopanaxelatusNakai.)为五加科刺参属，多年生落叶灌木,又名刺参、刺人参、长白山刺人参等,以根入药,有补气助阳、强心利尿的功效,收载于《中国植物志》[1]。东北刺人参主要分布于我国的吉林省长白山地区、朝鲜北部山区以及俄罗斯远东山区[2]。现代药理学研究发现,东北刺人参与人参的生物活性极为相似,都具有很高的药用价值,且安全性高、无毒副作用,在民间可替代人参应用,有“木本人参”的美誉[3]。

东北刺人参具有广泛的生物活性,其在临床上被用于治疗慢性疲劳综合症、神经衰弱、心血管疾病、糖尿病等多种疾病。胡彦武[4]用不同剂量东北刺人参茎给正常小鼠连续灌胃14 d,测定其负重游泳时间、耐缺氧时间、血乳酸含量,结果显示,东北刺人参茎能延长小鼠的耐缺氧时间和负重游泳时间,降低小鼠血乳酸含量。然而,目前国内外对东北刺人参根的抗疲劳作用的实验研究较少。因此,本文建立小鼠力竭游泳模型,分别考察东北刺人参根对小鼠负重游泳时间以及自由泳小鼠GSH-Px、LDH、ATPase和BUN等指标的影响。

本实验室前期研究发现,东北刺人参具有显著的改善睡眠作用,其作用机制与调节中枢神经递质含量有关[5],但东北刺人参对睡眠节律的影响尚未可知。本文结合以往研究,以野生型Canton S品系黑腹果蝇为观察对象[6],利用果蝇活动监测系统DAMS,研究东北刺人参根水提取物冻干粉对7日龄黑腹果蝇睡眠节律的干预作用，初步探讨东北刺人参改善睡眠质量及抗疲劳的作用,为东北刺人参生物活性的基础研究以及人工栽培品的应用及产品开发提供参考[7]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

ICR小鼠 雌雄各半,体重(20±2) g,SPF级,均由黑龙江中医药大学药物安全评价中心提供,许可证号:SCXK(黑)2013-004;野生型Canton S品系黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster) 7日龄,256只,雌雄各半,由北京大学生命科学学院提供;东北刺人参根 产自吉林省集安市野生药材种植基地,秋季采收,将其根洗净、切段、晾干、粉碎(过二号筛)、备用,经黑龙江中医药大学王振月教授鉴定为东北刺人参的根;蔗糖 分析纯,天津市滨海科迪化学试剂有限公司;琼脂 细菌学级,赛国生物科技有限责任公司;丙酸 分析纯,天津市福晨化学试剂厂;乙醇 分析纯,天津市富宇精细化工有限公司;酵母粉 食品级,英国OXOID公司;玉米粉 食品级,兴化联富食品有限公司;尿素氮测试盒(BUN)、乳酸脱氢酶测试盒(LDH)、考马斯亮蓝测试盒、谷胱甘肽-过氧化物酶测试盒(GSH-Px)、三磷酸腺苷测试盒(ATP) 以上试剂盒均产自南京建成成生物工程研究所。

N-1100D型旋转蒸发仪、FDU-1200型冷冻干燥机 上海爱朗仪器有限公司;FJ-200高速万能粉碎机 上海申胜仪器公司;HH. WZ. CY600电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备公司;AL 204电子天平 美国METTLER TOLEDO公司;EVOLUTION 260紫外分光光度计 美国Thermo公司;DAMS果蝇活动监测系统 Trikinetics Inc.Waltham,MA;EPOCH12酶标仪 美国BIOTEK公司。

1.2 实验方法

1.2.1 东北刺人参提取物溶液的制备 称取东北刺人参根粉末(过二号筛)200 g,分别用10倍量和8倍量体积的蒸馏水加热回流提取2次,每次1.5 h,合并提取液,过滤,50 ℃减压浓缩至1 mg/mL,冷冻干燥,得东北刺人参根水提取物冻干粉,备用。

1.2.2 小鼠实验环境 将ICR小鼠置于独立通气笼中饲养(噪音≤55 dB(A),换气次数:20～50 次/h,洁净度:100级,压差≥10 Pa,菌落数≤1 个/皿·时);外界温度(24±2) ℃,湿度55%±15%,光照强度:300 lux,12 h/12 h明暗交替(7:00～19:00光照;19:00～次日7:00黑暗)。

1.2.3 小鼠力竭游泳实验

1.2.3.1 实验分组及给药 选取ICR小鼠,置于实验环境中适应一周。随机分组,雌雄各半,分别为空白对照组,东北刺人参根冻干粉高、中、低剂量组(500、250、125 mg/kg),灌胃给药;空白组动物给予生理盐水溶液,给药容积为0.2 mL/10 g体重;连续给药15 d,末次给药后进行各项抗疲劳指标测定。

1.2.3.2 负重小鼠游泳时间的测定 力竭游泳实验中,将小鼠随机分成4组(空白对照组,东北刺人参根冻干粉高、中、低剂量组),每组12只,雌雄各半。末次灌胃给药30 min后,以小鼠体重的5%称取铅丝,在其尾根部负重,置于(25±1) ℃的恒温水箱(60 cm×40 cm×40 cm)中进行游泳,力竭标志为小鼠头部完全没入水中8 s不再浮起记录此时的负重游泳时间。期间可适时使用玻璃棒拨动小鼠,使其始终处于运动状态及避免抱团,但不可干扰其运动,记录小鼠从进入水中至游泳力竭的时间并计算延长率，延长率(%)=[(给药组平均负重游泳时间-空白组平均负重游泳时间)/空白组平均负重游泳时间]×100。

1.2.3.3 抗疲劳生理指标的测定 另取一批小鼠,随机分组,每组12只,雌雄各半,末次灌胃给药30 min后称重,颈椎脱臼处死,进行各项抗疲劳生理指标测定。

脏器指数:小鼠称重,处死,解剖取出脾脏、胸腺并用生理盐水洗去血液,滤纸吸干表面水分,分别称重,计算脏器指数。脏器指数(mg/g)=脏器重量/体重。

血清BUN含量和LDH活性的测定:小鼠不负重游泳90 min后,立即捞出小鼠,剪去胡须,摘眼球取血,静置,3000 r/min离心10 min,分离血清,4 ℃保存。参照血尿素氮测试盒、乳酸脱氢酶测试盒说明书方法,结合紫外可见光分光光度计测量血清BUN的含量及LDH活力。

GSH-Px、ATPase活力(Ca2+-Mg2+-ATPase和Na+-K+-ATPase)的测定:小鼠处死,解剖取出肝脏,预冷的生理盐水洗去血液,冰浴中制成10%肝匀浆。参照谷胱甘肽过氧化物酶测试盒和三磷酸腺苷测试盒说明书操作测定上述指标。

1.2.4 果蝇睡眠实验

1.2.4.1 果蝇实验环境 果蝇饲养于果蝇培养室中,通风、避光,采用自动定时光控系统对果蝇生活环境实行每天12 h的明暗光照周期处理,实验温度为(24±1) ℃,相对湿度为50%～60%。

1.2.4.2 果蝇培养基制备 培养基制备的配制参照卞宏生等[8]文献。在基础培养基配方基础上加入东北刺人参根冻干粉,按照文献方法制备成浓度分别为0.500%、0.250%、0.125%、0.0625%、0.0313%的含药培养基,完全凝固后,倒置于操作台面上,备用。

1.2.4.3 实验分组 以7日龄野生型Canton S品系黑腹果蝇作为观察对象。收集8 h内羽化未交配的果蝇,CO2轻微麻醉后区分雌、雄,分为空白组和东北刺人参给药组,每组32只。将新生果蝇置于相应环境中,基础培养基中培养3 d后,分别移入含基础培养基和含药培养基(0.500%、0.250%、0.125%、0.0625%、0.0313%)的监测管中,连续给药4 d,记录第7 d上午7:00至第8 d上午7:00雌雄果蝇的睡眠时间;同理,将新生果蝇培养3 d后,分别移入含基础培养基和含药培养基(0.500%、0.125%、0.0313%)的监测管中,记录雌雄果蝇的睡眠发生次数、自主活动次数及睡眠觉醒节律。

1.2.4.4 果蝇24 h睡眠觉醒节律监测 采用DAMS仪,监测果蝇早7:00至次日早7:00的睡眠。通过DAMS数据采集软件每隔5 min自动记录一次果蝇活动次数,连续记录的24 h。若5 min内活动次数记录为零,即果蝇静止时间持续5 min以上时,此休息状态符合睡眠行为标准,认为果蝇处于睡眠状态,记为果蝇睡眠时间[8]。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 小鼠力竭游泳时间

游泳时间是小鼠运动耐力的体现,是衡量药物抗疲劳作用的重要指标[9]。由表1可知,与空白组相比，东北刺人参高、中、低剂量组小鼠游泳时间均延长,其中东北刺人参高剂量组负重游泳时间增加具有统计学意义(P<0.05)。结果表明,东北刺人参能延长负重小鼠游泳时间,增强其抗疲劳能力。

表1 东北刺人参对负重小鼠力竭游泳时间的影响Table 1 Effects of Oplopanax elatus on swimming time of mice

注:“*”表示与空白对照组相比差异显著(P<0.05);“**”表示与空白对照组相比差异极显著(P<0.01);表2～表6同。

2.2 对脏器指数的影响

由表2可见,与空白对照组相比,各给药组小鼠的胸腺系数均大于空白对照组,但无统计学意义。刺人参冻干粉高、低剂量组的小鼠脾脏系数有增高趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。结果表明,东北刺人参具有一定增强机体免疫功能的作用。

表2 东北刺人参对游泳小鼠脏器指数的影响Table 2 Effects of Oplopanax elatus on viscera indices of mice

2.3 对血清BUN和LDH含量的影响

本实验的结果表明,各给药组小鼠血清BUN含量与空白对照组相比均降低,且东北刺人参冻干粉高剂量组的血清BUN降低的含量具有统计学意义(P<0.05),即说明了东北刺人参可以抑制或减少小鼠血尿素氮的产生,提高其抗疲劳能力[10]。同理,与空白对照组相比,刺人参冻干粉高剂量组的LDH活性升高有统计学意义(P<0.05)。结果表明,东北刺人参能提高游泳小鼠LDH活性,延缓疲劳产生或加速乳酸消除作用[10]。

表3 东北刺人参对游泳小鼠血BUN和LDH含量的影响Table 3 Effects of Oplopanax elatus on BUN and LDH content of mice

2.4 对GSH-Px活性的影响

由表4可知,与空白对照组相比,各给药组小鼠GSH-Px活性均升高,其中,刺人参冻干粉高剂量组的GSH活性升高有统计学意义(P<0.05)。实验结果表明,东北刺人参干预后小鼠的GSH-Px活性升高,提示刺人参与人参相似,可以减少自由基的堆积,加快体内脂质过氧化物的清除。

表4 东北刺人参对游泳小鼠GSH-Px 活性的影响Table 4 Effects of Oplopanax elatus on GSH-Px activity of swimming mice

2.5 对ATPase活力的影响

实验结果如表5所示,与空白对照组相比,刺人参冻干粉高剂量组的Ca2+-Mg2+-ATPase活力升高有统计学意义(P<0.05),提示东北刺人参能增加力竭游泳小鼠肝脏中Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase的含量,具有保护线粒体氧化磷酸化的作用[11]。

表5 东北刺人参对小鼠ATPase活力的影响Table 5 Effects of Oplopanax elatus on ATPase activity of mice

2.6 东北刺人参对果蝇睡眠时间的影响

由图1可知,与空白对照组相比,给药浓度为0.5000%、0.2500%、0.1250%、0.0625%和0.0313%组的东北刺人参对雄果蝇全天睡眠时间增加有极显著性影响(P<0.01);给药浓度为0.2500%和0.1250%组极显著降低雌果蝇的全天睡眠时间(P<0.01),其他各组无统计学意义。白天睡眠时间的影响结果显示,与空白组比较,各组雄果蝇白天睡眠时间增加有极显著影响(P<0.01);除0.0625%组与空白组比较无统计学意义外,其余各组均可不同程度减少雌果蝇白天睡眠时间。夜晚睡眠时间的影响结果显示,给药浓度为0.5000%和0.2500%组可不同程度增加雄果蝇夜晚睡眠时间,给药浓度为0.5000%和0.0313%组可极显著增加雌果蝇夜晚睡眠时间(P<0.01)。上述结果显示,东北刺人参能够显著延长雄果蝇的全天和白天睡眠时间,而雌果蝇白天睡眠时间显著减少。

图1 东北刺人参对7日龄果蝇平均睡眠-觉醒周期的影响Fig.1 Effects of Oplopanax elatus on average sleep-awakening of 7-day Drosophila注:“*”表示与空白对照组相比差异显著升高(P<0.05); “**”表示与空白对照组相比差异极显著升高(P<0.01); “#”表示与空白对照组相比差异显著降低(P<0.05); “##”表示与空白对照组相比差异 极显著降低(P<0.01)；图2同。

2.7 东北刺人参对7日龄果蝇睡眠发生次数的影响

由图2可知,与空白组比较,给药浓度为0.500%、0.125%和0.0313% 组的东北刺人参对雄果蝇的全天夜晚平均睡眠发生次数增加有极显著性影响(P<0.01),各给药组对雌果蝇的全天平均睡眠发生次数的影响无显著性意义;白天平均睡眠发生次数的影响结果显示,与空白组比较,0.5000%、0.1250%和0.0313%组与空白组比较雄果蝇的平均睡眠发生次数增加均有极显著差异(P<0.01),但各组不同程度减少雌果蝇白天平均睡眠发生次数;夜晚平均睡眠发生次数的影响结果显示,各给药组对雄果蝇的夜晚平均睡眠发生次数的影响无显著性意义;给药浓度为0.5000%和0.0313%组可极显著增加雌果蝇夜晚平均睡眠发生次数(P<0.01)。上述结果显示,东北刺人参能够显著增加雄果蝇的全天和白天平均睡眠发生次数,而对雌果蝇的影响体现在减少白天平均睡眠发生次数,增加夜晚平均睡眠发生次数。

图3 不同浓度东北刺人参干预后果蝇睡眠-觉醒图Fig.3 Effects of Oplopanax elatus on sleep-awakening of Drosophila注:图中白色部分表示活动,黑色部分表示睡眠。

图2 东北刺人参对果蝇平均睡眠发生次数的影响Fig.2 Effects of Oplopanax elatus on average number of sleeps of Drosophila

2.8 东北刺人参对7日龄果蝇自主活动的影响

由表6可知,与空白组比较,给药浓度为0.125%和0.0313%的东北刺人参对雄果蝇的自主活动次数降低有显著性影响(P<0.05或P<0.01),0.500%和0.0313%组减少雌果蝇的自主活动次数具有极显著意义(P<0.01)。

表6 东北刺人参对果蝇平均自主活动次数的影响Table 6 Effects of Oplopanax elatus on autonomic activity of Drosophila

2.9 东北刺人参对果蝇睡眠-觉醒节律改变的干预作用

由图3分析可知,不同浓度的东北刺人参主要是通过增加雄果蝇白天和夜晚睡眠时间,减少片段化睡眠,延长总睡眠时间。同时,其对雌果蝇睡眠的影响主要体现在减少白天活动时间,缩短果蝇片段化睡眠,增加夜晚睡眠时间,且明显后移睡眠相位角,这种作用以给药浓度为0.5000%最为明显。

3 结论与讨论

国内外文献报道,人参皂苷类成分具有显著的抗疲劳和抗应激作用[12-14]。东北刺人参与人参的生物活性相似,有学者报道东北刺人参茎能延长小鼠的耐缺氧时间和负重游泳时间,降低小鼠血乳酸含量。本实验考察了东北刺人参根的抗疲劳活性,研究显示,东北刺人参可显著延长负重小鼠的力竭游泳时间,提高运动耐力;东北刺人参能够降低BUN的含量,抑制体内蛋白质分解代谢及支链氨基酸代谢过程,缓解疲劳的发生;东北刺人参高剂量组小鼠LDH的含量均高于空白对照组,这表明其有助于提高乳酸脱氢酶的活性,延缓疲劳产生或加速乳酸消除作用[15-16];东北刺人参干预后小鼠的GSH-Px活性升高,表明其与人参相似,可以减少自由基的堆积,加快体内脂质过氧化物的清除[17];药物干预后小鼠的Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶含量均高于空白对照组,这表明了刺人参具有保护线粒体氧化磷酸化功能作用[18-19]。上述结果表明,东北刺人参根可以延长小鼠力竭游泳时间,提高其运动耐力,增加脏器指数,降低小鼠BUN含量,提高小鼠LDH与GSH活力,提高Ca2+-Mg2+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶活性,减少自由基的堆积,加快体内代谢产物的清除,发挥延缓疲劳的作用。

东北刺人参具有显著的改善睡眠作用,本实验考察了其对睡眠节律的影响。研究结果显示,东北刺人参根对果蝇睡眠-觉醒节律调节的最佳给药浓度为0.5000%,该药物能够显著延长雄果蝇的全天、白天平均睡眠时间和平均睡眠发生次数,减少自主活动次数,而雌果蝇白天睡眠时间显著减少,夜晚睡眠时间增加。通过分析药物干预前后睡眠-觉醒图我们发现,12/12 h明暗交替组的果蝇往往在19:00熄灯前后陆续出现睡眠状态,在次日6:00左右觉醒,而给予药物后的雌果蝇觉醒时间延迟至18:00

左右。这一现象在近日生理学中称为睡眠时相后移,而这种研究果蝇整体节律特点的方法,称为群体节律研究[20]。上述结果提示,东北刺人参根可以增加果蝇睡眠时间,减少自主活动次数,缩短片段化睡眠,且明显后移睡眠相位角,改善睡眠质量。

综上所述,东北刺人参根具有改善睡眠质量及抗疲劳的作用,但其发挥上述作用的物质基础和作用机制还有待进一步研究。东北刺人参具有广阔的开发前景,其生物活性的基础研究及人工栽培品的应用值得进一步探索。