UPLC-Q-Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用鉴别掺假蜂蜜

谢 博1,2,3,傅 红2,3,杨 方

(1.福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心,福建福州 350001; 2.福州大学生物科学与工程学院,福建福州 350108; 3.福州大学福建省海洋酶工程重点实验室,福建福州 350108)

蜂蜜富含丰富的矿物质、维生素、单糖、酶、氨基酸及其他酸类物质,具有抗菌消炎、抗氧化等多种生物活性,是天然的保健食品,也因此受到广大消费者的青睐[1-2]。然而,我国的很多蜂农和厂家受经济利益的驱使,向蜂蜜中添加外源糖浆、将低等蜂蜜掺入高等蜂蜜中以次充好,使得蜂蜜品质参差不齐,严重阻碍了蜂蜜市场的监管与管理[3]。

目前对于掺假蜂蜜的检测主要集中在糖类物质的研究。可根据掺入蜂蜜中糖浆的不同采取不同的检测方法,采用液相色谱-同位素比值质谱法、傅里叶变换近红外光谱分析法、拉曼光谱、荧光光谱、核磁共振、高效液相串联质谱法、薄层色谱法(TLC)等方法检测蜂蜜中C-3、C-4糖的含量,或是研究蜂蜜中C-3/C-4的比值[4-10]。但这些方法有的特异性高,一种方法只能检测掺入一种糖浆的蜂蜜,具有一定的局限性;有的方法操作复杂,耗时长,成本大,灵敏度低。除了以糖作为检测物质判定蜂蜜真假之外,因蜂蜜中含有约0.1%～0.5%的蛋白类物质,以蛋白类物质作为标准物检测蜂蜜真伪也成为学者们研究的新方向[11]。蜂蜜中加入糖浆或不同蜜源蜂蜜的混合会使原蜂蜜的蛋白丰度降低,或者原蜂蜜中可能存在外源性蜜源蛋白。Zhang等[12]基于两种抗蜂王浆主要蛋白1(MRJP1)的特异性多克隆抗体(POAB),研制了一种快速金夹心免疫层析条(GSIS),该方法可快速检测蜂蜜掺假。邓建军等[13]对不同蜂蜜进行SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析发现,掺假蜂蜜蛋白质含量明显低于真蜂蜜。蜂蜜中氨基酸的种类和含量与其来源密切相关,根据氨基酸的差异不仅可以区分蜂蜜的来源,还可衡量蜂蜜是否掺假[14]。Iglesias等[15]和Nisbet等[16]发现蜂蜜中脯氨酸含量≥180 mg/kg,且已将脯氨酸含量用作评价蜂蜜成熟度和蜂蜜掺假的标准。

多肽的特异性强,通过多肽定位的蛋白质可直接反映源物质的特点,因此从多肽的角度出发研究掺假食品已成为当今学者关注的热点。周广运等[17]采用超高效液相色谱-串联质谱法鉴定出了5种猪肉中存在的特异性多肽,可用于肉品掺假的鉴定。阳洪波等[18]采用液相色谱-质谱技术筛选出了3种猪源性胶原蛋白特征肽段,4种牛源性胶原蛋白特征肽段,1种羊源性胶原蛋白特征肽段,可用作胶原蛋白的鉴定。房芳等[19]采用鸟枪蛋白组学技术发现了可以鉴别阿胶及其他物种胶原蛋白的特异性肽段。但采用高效液相色谱-质谱联用技术鉴定掺假蜂蜜的报道较少。

本研究以UPLC-Q-Exactive联用的方法对2种掺假蜂蜜,4种未掺假蜂蜜胰蛋白酶酶解之后的肽段进行分析,通过检索Uniprot蛋白数据库得出多肽的序列及来源,对比掺假蜂蜜和未掺假蜂蜜多肽的区别,并筛选4种未掺假蜂蜜中共有而掺假蜂蜜中未检测到的肽段,为以蛋白类物质为基础研究蜂蜜掺假提供依据与实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

4种未掺假蜂蜜分别为枣花蜜、槐花蜜、金银花蜜、椴树蜜 均购自北京中蜜科技发展有限公司;2种掺假蜂蜜分别编号为1530和6344 经福建省出入境检验检疫技术中心同位素质谱鉴定,C-4糖含量分别为36.5%(1530)、68%(6344),C-4糖含量大于7%即视为掺假蜂蜜;三氯乙酸、碳酸氢铵为分析纯 购自国药集团产品;Tris 生工生物工程股份有限公司产品;二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)、碘乙酰胺(IAA)、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(3-((3-cholamidopropyl)dimethylammonium)-1-propanesulfonate,CHAPS) 美国Bio-Rad公司;胰蛋白酶 质谱测序级,乙腈、甲酸、甲醇 色谱纯,Thermo Fisher公司;C18固相萃取柱(3 mL,500 mg) 美国Supelco公司。

DIONEX UltiMate 3000超高效液相色谱 美国Dionex公司产品;四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪(Q-Exactive) 美国Thermo Fisher Scientific公司产品;UV-2700紫外-可见分光度计 日本岛津仪器有限公司产品;CR21N台式冷冻离心机 日立公司产品;FreeZone®TriadTM2.5 L冷冻干燥机 美国LABCONCO公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蜂蜜蛋白提取 称取蜂蜜约5 g溶于20%三氯乙酸(TCA)水溶液中,置于-20 ℃冰箱沉淀30 min。将溶液在4 ℃以5000 r/min离心10 min,弃去上清液。10 mL超纯水洗涤沉淀,再次离心。重复洗涤步骤,将最终的沉淀物溶解在2 mL超纯水中,冷冻后冻干[20]。

1.2.2 蜂蜜蛋白的紫外光谱扫描 用蒸馏水配制1 mg/mL蛋白质提取物溶液,取1 mL加入5 mL考马斯亮蓝,考马斯亮蓝与蛋白质形成蛋白质-染料复合物。温育2 min后,用紫外光谱仪进行全波长扫描[21]。

1.2.3 胰蛋白酶酶解 称取20 μg胰蛋白酶,加入20 μL 50 mmol/L乙酸溶解,配制成1 mg/mL溶液,用100 mmol/L Tris稀释至0.01 mg/mL。冻干蛋白质用 100 mmol/L NH4HCO3缓冲溶液(pH=7.4,含8 mol/L尿素)复溶,取质量浓度为1 mg/mL的蛋白溶液0.1 mL,加入DTT使其终浓度为20 mmol/L,于60 ℃水浴1 h后加入IAA使其终浓度为40 mmol/L,室温避光放置30 min后加入100 mmol/L NH4HCO3缓冲溶液使尿素终浓度≤1 mol/L,加入100 μL胰蛋白酶溶液,37 ℃酶解20～24 h。沸水浴10 min灭酶活,10000 r/min,4 ℃离心10 min,取上清液备用[17]。

1.2.4 净化 C18SPE柱依次用3 mL甲醇、3 mL水活化。取1.2.3中得到的上清液3 mL过柱,用3 mL甲醇洗脱,重复3～4次,收集洗脱液。45 ℃氮吹至近干,用1 mL的0.1%甲酸水溶液溶解,过0.45 μm滤膜,待测。

1.2.5 测定条件

1.2.5.1 色谱条件 Hypersil GOLD UPLC C18色谱柱,1.9 μm×100 mm×2.1 mm;柱温:30 ℃;流动相:A:0.1%甲酸水,B:乙腈,梯度洗脱程序:0～50 min(10%～90% B),50～55 min(90% B),55～56 min(90%～10% B),56～60 min(10% B);流速:0.2 mL/min;进样量:10 μL。

1.2.5.2 质谱条件 扫描模式：Full MS/dd-MS2，分析时长60 min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：100～1500 m/z，一级质谱分辨率:70000，AGC目标：le6，一级最大离子注入时间：100 ms，扫描范围数量：1，动态排除：40.0 s一次，MS2激活类型：HCD，质荷比窗口宽度：0.4 m/z，二级质谱分辨率：17500，微扫描次数：1，二级最大离子注入时间：50 ms，碰撞能量：30 eV，底部填充率：0.1%。

电喷雾离子源(ESI);载气为高纯氮气(纯度>99.5%),鞘气流速40个单位(arb),辅气流速15个单位(arb),吹扫气流速0个单位;喷雾电压3.2 kV;碰撞池采用梯度碰撞能量:25%、35%、55%;毛细管温度320 ℃,离子透镜电压频率(S-lens RF level)为60,辅气热源温度350 ℃。

1.3 数据处理

采用MaxQuant(版1.6.1.0)进行数据分析。搜索是针对来自蛋白质数据库Uniport的蜂蜜(uniprot-apis.fasta)的67051种蛋白质序列(2018年4月17日下载,https://www.uniprot.org/)。具体搜索参数为:蛋白假阳性率FDR设置为0.01;最小氨基酸长度设置为3;可变修饰设为N端乙酰化(N-Acetyl)、甲硫氨酸残基氧化(Oxidation(M));半胱氨酸固定化修饰设置为氨基甲酰化(Carbamidomethyl(C));酶为胰蛋白酶,最大裂解丢失设置为2,所有常见的污染物和相反的命中被删除[22]。

2 结果与分析

2.1 蜂蜜蛋白紫外光谱扫描结果

以4种未掺假蜂蜜中的椴树蜂蜜为例,2种掺假蜂蜜1530和6344以考马斯亮蓝G-250溶液进行染色后,在500～650 nm处进行全波长扫描,所得结果如图1所示。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色,最大吸收在488 nm,当与蛋白质结合后呈青蓝色,所形成的结合物在595 nm有最大吸收。从图1可以看出椴树蜂蜜在595 nm处有最大吸收,说明采用三氯乙酸沉淀法可以有效提取出椴树蜂蜜蛋白。而1530和6344在595 nm处曲线呈扁平状,吸收峰不明显,说明1530和6344蜂蜜中蛋白含量相对较少,这可能是因为掺入外源糖浆使原蜂蜜蛋白浓度减少。通过蜂蜜蛋白含量可区分蜂蜜来源及品质,Chen等[23]根据蜂蜜蛋白质含量区分中国台湾蜂蜜和泰国龙眼蜂蜜。Dong等[7]选取了35个不能从中提取蛋白质的蜂蜜,通过同位素鉴定为C-4糖或C-3糖掺假。由此可见,蜂蜜中能否提出蛋白质,提出蛋白质含量的多少可间接反映蜂蜜的品质及其是否掺假。

图1 真伪蜂蜜蛋白光谱扫描Fig.1 Spectral scanning of true and false honey protein

2.2 蜂蜜蛋白酶解结果

4种蜂蜜和2种掺假蜂蜜经1.2.1方法提取蜂蜜蛋白后,胰蛋白酶酶解,UPLC-Q-Exactive分析后的基峰色谱图如图2所示,峰的强度均在109,说明样品浓度较好,其中椴树蜜、槐花蜜、金银花蜜、枣花蜜的基峰色谱图表现出一定的相似性,6344和1530蜂蜜的基峰色谱图表现出一定的相似性,掺假蜂蜜和未掺假蜂蜜两组峰形相差较大。LC-MS/MS鉴定所得数据在Maxquant软件上进行分析,Maxquant软件可根据所得质谱图与蛋白数据库中的蛋白质序列进行比对,并给出分数,分数越高,Unique peptides越多,所得肽段越可信。肽段在蛋白质数据库Uniprot上进行Blast,可得多肽来源信息,去除评分较低及其他污染物的多肽,所得结果见表1～表6。

枣花蜜(表1)共鉴定出30条肽段,其中11条是蜂王浆主要蛋白(MRJPs)中MRJP1、MRJP2、MRJP3、MRJP4酶解的肽段,9条来自于未标记蛋白(Uncharacterized protein),其余10种是蜜蜂中的细菌(Bartonellaapis、Lactobacilluskunkeei、AscosphaeraapisARSEF 7405)中的酶及蛋白质酶解产生的肽段。

槐花蜜(表2)共鉴定到17条多肽,其中4条来自于蜂王浆主要蛋白1(MRJP1)和蜂王浆主要蛋白3(MRJP3),其他多肽来自于蜜蜂中存在的酶及未标记蛋白。

金银花蜜(表3)共鉴定出15条多肽,其中1条来自于蜂王浆主要蛋白1(MRJP1),7条来自于意大利蜜蜂中存在的未标记蛋白(Uncharacterized protein),剩余的7条多肽来自于蜜蜂中存在的酶以及受体蛋白等。

图2 4种蜂蜜与2种掺假蜂蜜酶解产物的LC-MS/MS总离子流图(TIC)Fig.2 LC-MS/MS total ion flow charts(TIC)of four honeys and two adulterated honey hydrolysates注：从上向下依次是椴树蜜、槐花蜜、金银花蜜、枣花蜜、6344、1530。

表1 枣花蜜酶解肽段序列Table 1 Sequences of enzymatic hydrolysis peptides in jujube honey

表2 槐花蜜酶解肽段序列Table 2 Sequences of enzymatic hydrolysis peptide sequences of Sophora japonica honey

表3 金银花蜜酶解肽段序列Table 3 Sequences of enzymatic hydrolysis peptide sequences of honeysuckle honey

椴树蜜(表4)共鉴定出18条多肽,其中4条来自于蜂王浆主要蛋白(MRJPs),2条来自于葡萄糖苷酶(Alpha-glucosidase),7条来自于未标记蛋白,1条来自于葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase),葡萄糖氧化酶可以将葡萄糖转化为葡萄糖酸内酯,然后水解成葡萄糖酸,且其产生的过氧化氢具有杀菌作用[15]。

6344蜂蜜(表5)共鉴定出3条多肽,主要来源于蜂蜜中细菌体内存在的蛋白,如Bartonellaapis(蜜蜂巴尔通体菌)的钼蛋白钼转移酶、AscosphaeraapisARSEF 7405(蜜蜂球囊菌ARSEF 7405)姐妹染色单体内聚因子等。

1530蜂蜜(表6)共鉴定出5条多肽,主要来自于意大利蜂蜜的未标记蛋白、TATA-结合蛋白相关因子、含PDZ结构域蛋白等。两种蜂蜜均未鉴定出来自于蜂王浆主要蛋白的多肽。

表4 椴树蜂蜜酶解肽段序列Table 4 Sequences of enzymatic hydrolysis peptide sequences of tilia honey

表5 6344酶解肽段序列Table 5 Sequences of enzymatic hydrolysis peptide sequences of 6344

表6 1530酶解肽段序列Table 6 Sequences of enzymatic hydrolysis peptide sequences of 1530

表7 6种蜂蜜多肽生物来源分析Table 7 Biological sources of 6 honey peptides

注:蜜蜂指Apisceranacerana、Apiscerana、Apismellifera。

2.3 多肽来源分析

从多肽的生物来源分析4种未掺假蜂蜜和2种掺假蜂蜜可以看出(表7),枣花蜜、槐花蜜、金银花蜜、椴树蜜有80%的多肽来自于蜜蜂(Apisceranacerana、Apiscerana、Apismellifera),其余20%主要来自蜂蜜中存在的一些细菌,四种未掺假蜂蜜均存在唯一肽段(Unique peptide)大于2的蛋白酶解产生的肽段,而掺假蜂蜜1530中虽然检测到了来自蜜蜂Apisceranacerana的多肽,但其对应的蛋白的唯一肽段(Unique peptide)为1,可信度不高。掺假较为严重的掺假蜂蜜6344(C-4含量为68%)中未检测到来自于蜜蜂(Apisceranacerana、Apiscerana、Apismellifera)的多肽。

从多肽的蛋白来源分析,4种未掺假蜂蜜中均不同程度的鉴定到来自MRJPs的多肽,而2种掺假蜂蜜均未检测出来自MRJPs的多肽。其中,蜂王浆主要蛋白1(MRJP1)是大量存在于蜂蜜中的蛋白[1]。4种未掺假蜂蜜均检测到了来自MRJP1的肽段,但掺假蜂蜜未检测出。其他学者也有类似的发现,Bilikova等[24]便以MRJP1为抗原制备抗体,采用酶联免疫吸附的方法快速检测掺假蜂蜜,并具有较好的准确性。Won等[25]采用MALDI-TOF鉴定出不同蜜蜂所产的MRJP1存在一定的差异,可以有效区分不同蜂蜜品种,掺假蜂蜜因掺入了外源糖浆和蜂蜜,蛋白质种类及含量会有所变化,通过区分掺假蜂蜜和未掺假蜂蜜的MRJP1同样可以鉴定掺假蜂蜜。由此可见,MRJP1或可能作为鉴定掺假蜂蜜的潜在标志物。

表8 肽段EYILVLSNK Maxquant分析结果Table 8 Analysis results of peptide EYILVLSNK by Maxquant

图3 MRJP1氨基酸排列图Fig.3 Amino acid alignment of MRJP1

2.4 差异性多肽的筛选

除了水分和糖之外,蜂蜜蛋白及其酶解多肽是蜂蜜的第三重要成分,蜂蜜的品质应根据其含有的蛋白质及多肽来确定,其中首先要关注的便是将花蜜转化为蜂蜜的酶及其酶解产物,其次便是蜂蜜中存在的蜂王浆主要蛋白[24]。另一方面,不同品种的蜂蜜含有各自的特征蛋白及其酶解肽段,也含有区别于其它食物的共同的蛋白及其酶解肽段,特征蛋白及其酶解肽段可以区别蜂蜜的种类,共同蛋白及其酶解肽段则可用来区别蜂蜜和其他食物,因此,也可用来区分未掺假蜂蜜和掺假蜂蜜。基于此,本研究对比了6种蜂蜜酶解后多肽序列发现,4种未掺假蜂蜜中均存在来自于MRJP1的多肽EYILVLSNK,本研究中的2种掺假蜂蜜中未检测到,且这条肽段所对应的蛋白质(MRJP1)是蜂蜜中的高丰度蛋白。将筛选到的多肽EYILVLSNK在Uniprot上进行蛋白质Blast,所得结果见图3,该多肽存在于MRJP1第376～384位,其生物详细信息见表8。由表8可以看出鉴定出的MRJP1含有2个唯一肽段(Unique peptide),且分数为117.39,表明该肽段及其所对应的MRJP1可信度较高。因此,多肽EYILVLSNK可区分本研究中的4种未掺假蜂蜜和2种掺假蜂蜜,也可作为鉴定掺假蜂蜜的潜在特异性多肽。

3 讨论与结论

蜂蜜掺假是目前蜂蜜市场上普遍存在的问题,快捷准确的辨别方法对于鉴定蜂蜜掺假具有重要意义。基于蛋白类物质来鉴定蜂蜜掺假主要集中在三个方面:a.分析蜂蜜中氨基酸的种类与含量以确定蜂蜜的来源以及是否掺假[11];b.分析蜂蜜中蛋白质的SDS-PAGE电泳行为差异以确定蜂蜜的差异[10,23];c.通过蜂蜜蛋白的免疫特性差异来区分蜂蜜来源及是否掺假[20,23]。这些方法具有一定的缺点,蜂蜜中氨基酸的种类和含量受地理、蜜源、气候等多种因素影响具有不稳定性[26];蜂蜜蛋白的电泳行为只能粗略的表现出不同蜂蜜蛋白的差异,无法精确定位差异蛋白;蜂蜜蛋白的免疫特性虽然可以有效区分不同蜂蜜,但是操作复杂,无法适应要求快速检测掺假蜂蜜的市场。蜂蜜中含有一定量的蛋白质,且不同蜂蜜蛋白质的含量和种类也存在差异,通过酶解蛋白,液相质谱鉴定的手段可直接得出蜂蜜多肽信息,不仅可以反映蜂蜜是否掺假,而且可以快速准确定位掺假蜂蜜和未掺假蜂蜜的差异蛋白,进而鉴定掺假蜂蜜。

本研究采用UPLC-Q-Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用的方法分析鉴定了4种未掺假蜂蜜及两种掺假蜂蜜多肽的组成及结构。结果表明,4种未掺假蜂蜜80%以上的肽段来自蜜蜂(Apisceranacerana、Apiscerana、Apismellifera),且含有蜂蜜中大量存在的蜂王浆主要蛋白家族(MRJPs)酶解产生的肽段,2种掺假蜂蜜中未检测出来自MRJPs酶解产生的多肽,且所有检测到的多肽对应的蛋白的唯一肽段(Unique peptides)为1,可信度不高。对比六种蜂蜜蛋白酶解结果发现,4种未掺假蜂蜜中均检测到了来自蜂王浆主要蛋白1(MRJP1)的多肽EYILVLSNK,该多肽对应的蛋白的唯一肽段(Unique peptides)为2,可信度较高,2种掺假蜂蜜中未检测到多肽EYILVLSNK,多肽EYILVLSNK作为掺假蜂蜜和未掺假蜂蜜的差异肽段,可辨别本研究中的真伪蜂蜜,或可作为鉴定掺假蜂蜜的潜在特异性多肽。这一结果不仅为基于蛋白类物质辨别蜂蜜真伪提供实验基础,而且为鉴定掺假蜂蜜提供新的思路。