酸枣仁黄酮对照提取物的制备及其在枣仁安神颗粒含量测定中的方法学验证

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(1.华中科技大学协和江北医院,武汉市蔡甸区人民医院,湖北武汉 430100; 2.清华大学工程物理系,教育部粒子与辐射成像重点实验室,北京 100084; 3.湖北中医药大学药学院,教育部中药资源与中药复方重点实验室,湖北武汉 430065)

中药的活性成分是决定药品质量优劣、有效性和安全性的主要因素,但其成分复杂,以单一成分为指标难以全面地评价其质量,且单一对照品的提取分离难度大、成本高、价格昂贵,制约了中药标准化和现代化的发展[1-4]。对照提取物是一类非单体成分的标准物质,其制备成本低,可对中药进行多指标质量控制,提高药品检验效率[5-8]。2015年版《中国药典》收载了21个对照提取物[5,9],采用标示含量的对照提取物替代单一对照品作为含量测定对照物质,是中药质量控制的新趋势。

酸枣仁为鼠李科植物酸枣(ZiziphusjujubaMill. var. Spinosa(Bunge)Hu ex H. F. Chou)的干燥成熟种子,收载于历版《中国药典》,具有宁心、安神、敛汗功效,用于虚烦不眠、惊悸怔忡、烦渴虚汗等症,为养心安神的首选药品[10-12]。酸枣仁含有斯皮诺素、6‴-阿魏酰斯皮诺素、6‴-对香豆酰斯皮诺素等黄酮类成分,此外还含有皂苷、生物碱等多种成分[13-16]。现代药理学研究表明黄酮类是酸枣仁主要活性成分,具有镇静、催眠、抗焦虑、抗抑郁等作用[16-19]。2015年版《中国药典》酸枣仁及其制剂项下规定仅以斯皮诺素的含量作为酸枣仁黄酮类成分的定量检测指标[10,20],不能全面反映其质量。

为提高酸枣仁及其制剂质量与检测效率,本文制备并标定酸枣仁黄酮对照提取物,并以此为对照,测定酸枣仁制剂中斯皮诺素、6‴-阿魏酰斯皮诺素两种活性成分含量。同时,与单一对照品为对照的测定结果进行对比,为对照提取物用于酸枣仁及其制剂多指标的质量控制提供依据,探讨对照提取物作为一种标准物质在中药质量控制中应用的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酸枣仁粗提物 宁夏香草生物技术有限公司;枣仁安神颗粒 共12批,来源于4个厂家,具体信息见表1;斯皮诺素、6‴-阿魏酰斯皮诺素 上海同田生物科技有限公司;乙腈、乙酸 均为色谱纯,美国Sigma-Aldrich公司;实验用水 超纯水。

表1 12批枣仁安神颗粒样品 Tabel 1 Samples information of 12 batches Zaoren Anshen granule

岛津LC-20A液相色谱系统(SIL-20A自动进样器、LC-20AB四元高压泵、CTO-20AC柱温箱、SPD-20A紫外检测器、Labsolutions色谱工作站) 日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 对照提取物的制备 取100 g酸枣仁粗提物,加200 mL水分散,过滤,用3倍体积石油醚连续萃取3次,静置24 h,弃去石油醚部位。取D101大孔树脂1 kg,用95%甲醇浸泡24 h,装柱,用水洗脱至无醇味。将酸枣仁粗提物水部位置于色谱柱内,并配制水、20%、40%、60%、95%甲醇各5 L,依次梯度洗脱,收集馏分,每瓶100 mL;利用薄层硅胶板检测合并馏分,得到5个馏分(Fr.1～Fr.5);经减压回收甲醇、冷冻干燥,得到Fr.3酸枣仁黄酮提取物粉末2.3 g。

取Fr.3酸枣仁黄酮提取物粉末2.3 g,用丙酮溶解,加入5 g硅胶(100目)拌样,溶剂挥发完全。取50 g硅胶(300目)干法装柱,加入拌样硅胶,用氯仿-甲醇(7∶3,V/V)等梯度洗脱,收集馏分,每瓶20 mL;利用薄层硅胶板检测合并流份,经减压回收、冷冻干燥,得到酸枣仁黄酮对照提取物1.2 g。

1.2.2 混合对照品溶液的制备 将斯皮诺素、6‴-阿魏酰斯皮诺素作为指标成分,分别精密称取斯皮诺素对照品6.05 mg,6‴-阿魏酰斯皮诺素对照品4.03 mg于10 mL容量瓶中,加70%甲醇溶解,定容至刻度线,摇匀。移液管精密量取0.10、0.20、1.00、2.00、5.00 mL溶液,至10 mL容量瓶中,稀释,定容至刻度,制成不同浓度的混合对照品溶液(斯皮诺素浓度为0.0061、0.0121、0.0605、0.121、0.3025 mg·mL-1,6‴-阿魏酰斯皮诺素浓度为0.0040、0.0081、0.0403、0.0806、0.2015 mg·mL-1),备用。

1.2.3 酸枣仁黄酮对照提取物溶液的制备 精密称取酸枣仁黄酮对照提取物5.00 mg,共6份,置于25 mL容量瓶中,加70%甲醇溶解,定容至刻度线,摇匀,备用,进行专属性实验、重复性实验、精密度实验、稳定性实验。

精密称定酸枣仁黄酮对照提取物40 mg,置25 mL容量瓶中,加70%甲醇溶解,定容至刻度线,摇匀,静置。移液管精密量取0.1、0.2、1.0、2.0、5.0 mL溶液,置10 mL容量瓶中,稀释,定容至刻度,摇匀,制成不同浓度的混合对照品溶液(斯皮诺素浓度为0.0087、0.0175、0.0873、0.1746、0.4366 mg·mL-1,6‴-阿魏酰斯皮诺素浓度为0.0039、0.0078、0.039、0.0781、0.1952 mg·mL-1),备用,进行线性关系考察。

1.2.4 枣仁安神颗粒供试品溶液的制备 取表1中枣仁安神颗粒样品1～12,分别精密称取5.00 g,研磨,加入30 mL 70%甲醇溶解,超声30 min,常温静置,过0.45 μm滤膜,取滤液,静置,备用。

1.2.5 阴性样品溶液的制备 按2015年版《中国药典》处方及制法,取丹参(100 g)、醋制五味子(100 g)2味药材制得酸枣仁阴性样品[20],并按1.2.4项制备阴性供试品溶液,备用。

表2 指标成分的回归方程及线性范围Table 2 Regression equations and linear ranges of the maker components

1.2.6 色谱条件 色谱柱:Kromasil 100-5C18(5 μm,4.6×250 mm2);流动相:0.1%乙酸水溶液为流动相A,乙腈为流动相B,梯度洗脱条件:0～10 min,86%→84% A;10～50 min,84%→80% A;50～60 min,80%→50% A;流速:1.0 mL·min-1;检测器波长:335 nm[21];进样体积:10 μL;柱温箱温度:22 ℃。

1.2.7 方法学考察

1.2.7.1 线性关系考察 取1.2.2项下配制的不同浓度混合对照品溶液、1.2.3项下配制的不同浓度对照提取物溶液,按照1.2.6项下色谱条件进行HPLC测定,以指标成分峰面积为纵坐标,指标成分的浓度为横坐标,绘制标准曲线,计算各指标成分回归方程。

1.2.7.2 专属性实验 取1.2.2项下配制的混合对照品溶液、1.2.3项下配制的对照提取物溶液、1.2.4项下配制的不同厂家枣仁安神颗粒供试品溶液、1.2.5项下配制的阴性样品溶液,按照1.2.6项下色谱条件,测定指标成分。

1.2.7.3 精密度实验 日内精密度：取1.2.3项下配制的对照提取物溶液1份,按1.2.6项下色谱条件,连续进样6次,测定指标成分含量,并计算峰面积RSD。日间精密度:取上述对照提取物溶液,按1.2.6项下色谱条件,6日内每日进样1次,测定指标成分峰面积,并计算RSD。

1.2.7.4 稳定性实验 取1.2.3项下配制的对照提取物溶液1份,常温放置,分别于0、4、8、12、24 h进样,按1.2.6项下色谱条件,测定指标成分峰面积,并计算RSD。

1.2.7.5 重复性实验 取1.2.3项下配制的对照提取物溶液6份,常温放置,按1.2.6项下色谱条件,测定指标成分峰面积,并计算RSD。

1.2.7.6 加样回收率实验 精密称定已知含量的酸枣仁安神颗粒2.5 g,共9份,按1.2.4项制备供试品溶液,分别加入不同剂量对照提取物,分为低、中、高三个水平组,在1.2.6项下色谱条件,测定指标成分含量,计算加样回收率和RSD。

1.2.8 对照提取物含量测定 取1.2.3项下配制的酸枣仁黄酮对照提取物溶液3份,按1.2.6项下色谱条件,每批平行操作3次,记录峰面积,测定指标成分,以外标法计算含量。

1.2.9 枣仁安神颗粒含量测定 取1.2.4项下配制的枣仁安神颗粒供试品溶液,按1.2.6项下色谱条件,每批平行操作3次,记录峰面积,测定指标成分,以外标法计算含量。

1.3 数据处理

实验数据分别由Excel、Origin 9.0和SPSS软件处理。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 线性关系考察 由表2可知,对照品斯皮诺素、6‴-阿魏酰斯皮诺素浓度在0.0061、0.3025、0.004、0.2015 mg·mL-1范围内与峰面积具有良好的线性关系,对照提取物中斯皮诺素、6‴-阿魏酰斯皮诺素浓度在0.0087～0.4366、0.0039～0.1952 mg·mL-1范围内与峰面积具有良好的线性关系。

2.1.2 专属性实验 由图1可知,枣仁安神颗粒供试品溶液色谱图中,在斯皮诺素、6‴-阿魏酰斯皮诺素保留时间处无其他成分干扰。

图1 对照品、对照提取物、阴性样品与不同厂家的 枣仁安神颗粒HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of reference standard,the standard reference extract,the negative sample and Zaoren Anshen granules from different manufacturers注:1:斯皮诺素;2:6‴-阿魏酰斯皮诺素; No.1～No.4:枣仁安神颗粒样品1、4、8、11。

2.1.3 精密度实验 由表3结果可知,日内精密度的斯皮诺素、6‴-阿魏酰斯皮诺素峰面积 RSD 分别为 0.14%、0.16%;日间精密度的斯皮诺素、6‴-阿魏酰斯皮诺素峰面积 RSD 分别为 0.28%、0.24%。结果表明,以斯皮诺素、6‴-阿魏酰斯皮诺素建立的高效液相色谱法精密度良好。

2.1.4 稳定性实验 由表3结果可知,斯皮诺素、6‴-阿魏酰斯皮诺素峰面积 RSD 分别为 0.15%、0.25%。结果表明溶液中斯皮诺素、6‴-阿魏酰斯皮诺素在24 h内稳定性良好。

2.1.5 重复性实验 由表3结果可知,斯皮诺素、6‴-阿魏酰斯皮诺素峰面积RSD分别为 1.52%、1.93%。结果表明,以斯皮诺素、6‴-阿魏酰斯皮诺素建立的高效液相色谱法重复性良好。

2.1.6 加样回收率实验 由表4结果可知,供试品溶液中斯皮诺素、6‴-阿魏酰斯皮诺素加样回收率为100.26%、100.90%,说明各成分回收率良好。

表3 指标成分的精密度、稳定性、重复性试验的的相对标准偏差Table 3 Precision,stability and reproducibility tests of the maker components

表4 指标成分的加标回收率Table 4 Recoveries of the maker components

2.2 对照提取物含量测定

以外标法计算斯皮诺素、6‴-阿魏酰斯皮诺素含量,由表5结果可知,酸枣仁黄酮对照提取物的纯度为78.97%,斯皮诺素、6‴-阿魏酰斯皮诺素含量分别为54.57%、24.40%。

表5 酸枣仁对照提取物成分含量测定结果Table 5 Contents of the control extract of Ziziphus jujuba seeds

2.3 枣仁安神颗粒含量测定

以1.2.2项下混合对照品溶液及1.2.3项下对照提取物溶液为对照,用外标法分别计算斯皮诺素、6‴-阿魏酰斯皮诺素含量,由表6结果可知,以对照提取物及单体对照品为对照的2种方法测定同批次样品的结果。

表6 12批枣仁安神颗粒中指标成分的含量Table 6 Contents of the maker components in 12 batches of Zaoren Anshen granules

将对照提取物测定12批枣仁安神颗粒中指标成分含量的结果与采用单一对照品测定的结果进行比较,由表 7 结果可知,两种测定方法所得数据间RSD分别为0.49%～1.57%、0.52%～1.59%,均低于2%,结果表明两种方法的测定结果之间没有显著性差异,以对照提取物及单体对照品为对照的2种方法测定同批次样品的结果基本一致。

采用配对T检验的方法对两种方法测得的结果进行比较,由表7结果可知,斯皮诺素、6‴-阿魏酰斯皮诺素相关性分析得到的相关系数分别为0.999、0.998,均大于0.95;P值分别为0.318、0.084,均大于0.05,结果表明二者之间不存在显著性差异,以对照提取物及单体对照品为对照的2种方法测定同批次样品的结果基本一致。

表7 枣仁安神颗粒含量测定结果相似性比较Table 7 Similarity comparison of the determination results of Zaoren Anshen granules

3 结论

斯皮诺素和6‴-阿魏酰斯皮诺素是酸枣仁所含的活性成分,本文自制并标定了酸枣仁黄酮对照提取物成分含量,酸枣仁黄酮对照提取物的纯度为78.97%,斯皮诺素、6‴-阿魏酰斯皮诺素含量分别为54.57%、24.40%。将标示含量的对照提取物用于酸枣仁安神颗粒的斯皮诺素、6‴-阿魏酰斯皮诺素含量测定,与单一对照品测定结果进行对比,两组数据间相对标准偏差RSD小于2%,配对t检验得到的相关系数大于0.95(P>0.05)。结果表明,两种测定方法的结果无显著性差异,酸枣仁黄酮对照提取物可以替代单一对照品对其中药材及制剂的目标成分进行含量测定及质量控制。

相对于单一对照品,对照提取物的分离制备难度小,便于大量制备,价格低廉,节约了研究成本。用对照提取物进行多指标成分含量测定,减少了对照品的使用,简化了实验操作与研究内容,方法快速、准确。本文的研究结果初步验证了对照提取物适用于中药成分含量的测定及质量控制,为对照提取物的应用提供参考依据。