分子印迹掺杂金属有机框架固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法 测定大米中10种磺酰脲类除草剂

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(1.河北北方学院,河北省农产品食品质量安全分析检测重点实验室,河北张家口 075000; 2.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所,农业部农产品质量安全重点实验室,北京 100081)

磺酰脲类除草剂(Sulfonylurea herbicide)的结构通式为芳香基、磺酰脲桥和杂环三部分,主要用于水稻、大豆、玉米、油菜等的杂草防治,是目前世界各国应用范围最广、用量最大的除草剂之一[1-2]。磺酰脲类除草剂水溶性极强,易进入土壤并造成水体污染,不仅影响农作物、藻类及鱼类的繁殖和发育,还可通过食物链富集传递对人体健康造成危害[3]。因此,中国、美国、日本、欧盟等多个国家和地区均针对不同农产品规定了磺酰脲类除草剂的残留限量[4]。

目前,磺酰脲类除草剂的主要检测方法有酶联免疫法(ELISA)[5]、高效液相色谱法(HPLC)[6]、毛细管电泳法(CE)[7]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[8-9]等。测定的样品主要涉及粮谷、土壤和水等基质。近年来,液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)以其灵敏度高、选择性强等优点,成为了磺酰脲类除草剂的主要检测手段,但其前处理步骤存在操作繁琐,基质干扰严重,检测药剂种类单一等缺点,急需研发类特异性吸附效果好、富集能力强、简便快速的新型固相萃取材料。

分子印迹聚合物(Molecularly imprinted polymer,MIP)是由分子印迹技术(Molecularly imprinted technique,MIT)合成的一种兼具特异性识别和富集能力的高分子材料[10]。以其作为填料的分子印迹固相萃取技术(MISPE)极大地降低了基质干扰,提高了检测的灵敏度和准确性。郑亚丽等[11]和Tang等[12]分别建立了分子印迹固相萃取与高效液相色谱联用测定烟叶和大米中磺酰脲类除草剂的检测技术。金属有机框架(Metal organic frameworks,MOFs)是一种以金属离子为中心,通过配位键与有机配体自组装形成的多孔网状材料[13-14]。MOFs材料因其具有架构与功能多样性、比表面积和孔隙率较大、孔径大小可调控、生物兼容性强等优点[15-16],在气体吸附存储、传感器、药物缓释等领域应用广泛,近年来也被拓展应用于农药残留[17-18]、重金属[19-20]、多环芳烃[21]等食品有害物质的痕量分析前处理中。

本研究集磺酰脲类除草剂MIP与MOFs材料的优势,以MOFs-MIP为复合吸附剂的固相萃取法对样品进行分离、净化和富集,极大提高了前处理步骤的选择性和效率,结合HPLC-MS/MS法实现了对大米中10种磺酰脲类除草剂的高通量、快速痕量检测,为大米等粮谷类农产品中磺酰脲类除草剂残留的监管提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

10种磺酰脲类除草剂(甲磺隆、氯磺隆、氯嘧磺隆、单嘧磺隆、噻吩磺隆、氟磺隆、氟胺磺隆、烟嘧磺隆、苄嘧磺隆、吡嘧磺隆)标准品 色谱纯,德国Dr. Ehrerstorfer公司;甲磺隆、4-乙烯基吡啶(4-VP)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA) 分析纯,北京百灵威科技有限公司;2-甲基咪唑、六水合硝酸锌 分析纯,美国Sigma公司;甲醇、乙腈、甲酸 色谱纯,德国 Merck公司;大米 某超市。

Waters 2695型高效液相色谱仪、Waters 2998型二极管阵列检测器、Waters X Bridge C18色谱柱(250×4.6 mm,5 μm) 美国Waters公司;Agilent 1200型液相色谱仪、ZORBAX SB-C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,3.5 μm) 美国Agilent公司;API 5000型串联四级杆质谱仪 美国AB SCIEX公司;SHZ-B水浴恒温振荡器 上海旌派仪器有限公司;Thermo Fisher ST8 ST8R台式高速冷冻离心机 美国Thermo Fisher公司;Milli-Q超纯水系统 美国Millipore公司;SU8020 扫描电子显微镜 日本 Hitachi公司。

1.2 实验方法

1.2.1 磺酰脲类除草剂MIP的制备 以甲磺隆为模板分子,4-乙烯吡啶(4-VP)为功能单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)为交联剂,按照摩尔质量1∶4∶20的比例,以乙腈作为溶剂构建分子印迹聚合体系,参考Bastide等[22]的沉淀聚合法制备MIP。非印迹聚合物(NIP)的制备过程除不加入模板分子外,其他步骤同上。采用扫描电镜(SEM)对合成的MIP和NIP进行表征分析。

1.2.2 MOFs材料的制备 采用液相扩散法制备MOFs材料中的沸石咪唑骨架(ZIF-8)[23]。称取六水合硝酸锌1.8 g,2-甲基咪唑3.9 g,分别加入50 mL离心管中,各加入30 mL乙腈常温下500 W超声5 min至其充分混匀,将上述两溶液转移至锥形瓶中混合,常温下搅拌30 min,所得混合物经乙醇洗涤7次,60 ℃下烘干24 h至充分干燥待用。采用SEM对合成材料进行表征分析。

表1 10种磺酰脲类除草剂质谱分析参数Table 1 Mass spectrometry parameters for analysis of 10 kinds of sulfonylurea herbicides

注:*:定量离子(Quantitative ion)。

1.2.3 MOFs-MIP固相萃取方法的优化 采用干法装柱法制备固相萃取柱。分别称取40 mg MIP与10 mg MOFs材料涡旋振荡混匀。预先在空柱内装入第一片20 μm孔径的筛板,再将上述复合填料移入小柱中加盖第二片筛板,并用玻璃棒以适当力度推动第二片筛板压紧填料,制成MOFs-MIP固相萃取柱。以甲磺隆、吡嘧磺隆作为代表性目标物,结合两种填料的解吸特性,通过测定其回收率优化该复合SPE柱的活化、上样、淋洗及洗脱条件。

1.2.4 高效液相色谱分析条件 色谱柱:ZORBAX SB-C18柱(100×2.1 mm,3.5 μm);柱温:25 ℃;进样体积:5 μL;流速:300 μL/min。流动相A:0.1%甲酸水,流动相B:0.1%甲酸乙腈,梯度洗脱程序:0～2 min,10%～40% B;2～6 min,40%～60% B;6～12 min,60%～90% B;12～15 min,90% B;15～15.1 min,90%～10% B;15.1～21 min,10% B。

1.2.5 质谱分析条件 多重反应监测(MRM)模式;电喷雾离子源(ESI);正离子扫描模式;喷雾电压(IS+):5500 V;离子源温度(TEM):450 ℃;气帘气(CUR):15 psi,雾化气压力(GS1):14 psi,加热辅助气压力(GS2):20 psi。10种磺酰脲类除草剂质谱分析参数见表1。

1.2.6 大米实际样品检测 准确称取10 g粉碎后过830 μm筛的大米样品于50 mL离心管中,加入10种磺酰脲类除草剂混合标准品,再加入5 mL超纯水,涡旋30 s;加入10 mL乙腈,涡旋30 s;加入1 g氯化钠和4 g无水硫酸镁,涡旋2 min,5000 r/min离心5 min。取1 mL上清液,缓慢氮吹至干并加入1 mL乙腈复溶,过0.22 μm有机滤膜,待净化。

MOFs-MIP固相萃取柱依次用5 mL乙腈和5 mL超纯水活化。取5 mL待净化液上样后,用3 mL超纯水淋洗并抽干。依次加入10 mL乙酸-甲醇溶液(1∶9,V/V)和5 mL丙酮洗脱,合并洗脱液在45 ℃下氮气吹干。残渣加入1 mL乙腈复溶,过0.22 μm有机滤膜,装入样品瓶中进行HPLC-MS/MS测定。

1.3 数据处理

利用Microsoft Office Excel 2010版对数据进行分析,使用Origin 9.0软件绘图。

2 结果与分析

2.1 磺酰脲类除草剂MIP的表征分析

采用扫描电镜对制备的磺酰脲类除草剂MIP与NIP的表面形态进行表征,可知MIP(图1a)微球结构清晰完整,大小均一(直径为1 μm左右),表面具有明显的褶皱状结构,揭示其可能有更大的比表面积和更多的识别位点。而NIP(图1b)结构之间交联紧密,表面较为平滑,无明显特征结构。

图1 磺酰脲类除草剂(a)MIP 和(b)NIP扫描电镜图(50000×)Fig.1 SEM images of the prepared sulfonylurea herbicide(a)MIP and(b)NIP(50000×)

2.2 MOFs的扫描电镜表征分析

本试验中所制备的MOFs材料为ZIFs 系列中的ZIF-8。ZIFs是一类具有沸石骨架结构的MOFs材料,是由过渡金属离子Zn2+和Co2+等通过咪唑或功能化咪唑连接而成的四面体簇,ZIF-8是该系列中的典型代表。图2是不同倍率下ZIF-8的扫描电镜图,其形貌较均一,微粒外形具有明显的棱角,平均粒径为500 nm左右,整体呈现聚合堆积状态,有机配体和金属离子的排列具有明显的方向性,具有超高的比表面积和孔隙率,与Han等[24]的结果一致。

图2 MOFs材料扫描电镜图Fig.2 SEM images of the prepared MOFs注:a:放大倍数为100000倍;b:放大倍数为50000倍。

2.3 MOFs-MIP固相萃取条件的优化

2.3.1 活化液的选择 固相萃取的活化液分别受到MIP的识别环境及MOFs材料的吸附条件等因素的影响。由预试验可知本研究中制备的MIP在纯乙腈溶剂条件下可实现对目标物的类特异性吸附,而MOFs材料具有良好的亲水性,在水相比例较高的溶剂中对目标物吸附性较好。因此,本试验考察了5 mL乙腈、5 mL乙腈+5 mL水、5 mL乙腈-二氯甲烷(1∶1,V/V)三种活化液对固相萃取柱的活化效果。如图3所示,采用乙腈-水作为活化液对甲磺隆和吡嘧磺隆两种除草剂均有良好的吸附回收(平均回收率分别为98.6%、94.8%)。因此本试验选择乙腈-水作为活化液。

图3 不同活化液对磺酰脲类除草剂回收率的影响Fig.3 Effects of different activators on recoveries of sulfonylurea herbicides

2.3.2 上样液的选择 本试验选取不同比例的乙腈水溶液(100%乙腈、95%乙腈、90%乙腈、80%乙腈)作为上样液,考察了甲磺隆和吡嘧磺隆在SPE柱上的保留效果。如图4所示,各上样液对甲磺隆的回收率无明显影响,采用纯乙腈溶剂为上样液时吡嘧磺隆在SPE柱上几乎无保留,而随着上样液中水相比例的逐渐增加,吡嘧磺隆的回收率明显上升,因此本试验选择80%乙腈作为上样液。

图4 不同上样液对磺酰脲类除草剂回收率的影响Fig.4 Effects of different loading solutions on recoveries of sulfonylurea herbicides

图5 不同淋洗液对磺酰脲类除草剂回收率的影响Fig.5 Effects of different washing solutions on recoveries of sulfonylurea herbicides

2.3.3 淋洗液的选择 淋洗剂的选择是影响固相萃取柱回收率的重要因素,它不仅能去除非特异性结合的杂质,而且还能最大程度地保留目标化合物,从而提高检测的准确性和灵敏度。本试验考察了乙腈、甲醇、正己烷、水、80%乙腈、80%甲醇六种淋洗液的淋洗效果。如图5所示,用水作为淋洗液时两种除草剂均达到了最大平均回收率(98.3%,97.3%),而乙腈、甲醇对MOFs材料具有一定的解吸作用,影响了回收效果。因此本试验选择水作为淋洗液。

2.3.4 洗脱液的选择 洗脱液的选择需综合考虑两种材料的解吸特性,

图6 洗脱液对磺酰脲类除草剂回收率的影响Fig.6 Effects of different elution solutions on recoveries of sulfonylurea herbicides注:1:10 mL乙腈;2:10 mL 甲醇;3:10 mL丙酮; 4:10 mL乙腈+5 mL丙酮先后洗脱; 5:10 mL甲醇+5 mL丙酮先后洗脱; 6:10 mL乙酸-甲醇(1∶9，V∶V)+5 mL丙酮先后洗脱。

本试验考察了10 mL乙腈、10 mL甲醇、10 mL丙酮、10 mL乙腈与5 mL丙酮先后洗脱、10 mL甲醇与5 mL丙酮先后洗脱、10 mL乙酸-甲醇(1∶9,V∶V)与5 mL丙酮先后洗脱六种洗脱模式的洗脱效果。如图6所示,采用10 mL乙酸-甲醇(1∶9,V∶V)与5 mL丙酮先后洗脱的方式可实现两种除草剂的最大平均回收率(96.2%,95.7%)。因此本试验选择10 mL乙酸-甲醇(1∶9,V/V)与5 mL丙酮先后洗脱作为洗脱方式。

2.4 填料组分配比的优化

为了考察不同填料组分配比对磺酰脲类除草剂的类特异性吸附效果,本试验将40 mg MIP分别与5、10、20 mg MOFs材料混合,按照2.3的优化固相萃取条件(5 mL乙腈+5 mL水为活化液,80%乙腈-水为上样液,3 mL水淋洗,10 mL乙酸-甲醇(1∶9,V/V)与5 mL丙酮先后洗脱),对10种磺酰脲类除草剂进行富集测定,标准溶液浓度为5 μg/mL。由表2可知,除氯磺隆外,MOFs材料为10 mg 时的回收率均大于其为5 mg 时的回收率,MOFs材料为10 mg与20 mg时的回收率非常接近,且均可满足检测需要。从材料经济角度考虑最终选取40 mg MIP与10 mg MOFs材料混合作为SPE柱填料配比。

2.5 SPE柱的重复利用性

本试验考察了3根MOFs-MIP SPE柱的重复利用效果,用上样液配制1 μg/mL的10种磺酰脲类除草剂混合标准溶液,在2.3的优化固相萃取条件下反复多次平行测定。结果由表3、表4、表5可知,SPE柱在重复利用10次后除氟胺磺隆、烟嘧磺隆、吡嘧磺隆的平均回收率下降到69%、74%、69%外,其余除草剂的回收率依然保持在80%～95%之间,表明该SPE柱具有良好的重复利用性。

表3 平行测试1Table 3 Parallel experiment 1

表4 平行测试2Table 4 Parallel experiment 2

表2 不同填料组分配比固相萃取检测 10种磺酰脲类除草剂的回收率Table 2 Recoveries of 10 kinds of sulfonylurea herbicides detected by SPE cartridge with different component proportions of fillers

2.6 方法学评价及大米样品测定

用大米空白样品基质配制成1、2、5、10、20、50、100 μg/kg系列浓度梯度的10种磺酰脲类除草剂混合标准溶液,10种磺酰脲农药总离子色谱图如图7所示,在1.2.4和1.2.5的仪器分析条件下进行测定并绘制标准曲线,10种磺酰脲农药的标准线性方程和相关系数r如表6所示。结果表明,标准曲线在1～100 μg/kg范围内呈现良好的线性关系,相关系数(r)均大于0.991,初步表明在此范围内可进行定量分析。取定量离子信噪比S/N=3对应的浓度为样品的检出限(LOD),S/N=10对应的浓度为样品的定量限(LOQ),方法LOD和LOQ分别在0.07～0.50和0.23～1.70 μg/kg之间。测得的噻吩磺隆的LOD为0.07 μg/kg,单嘧磺隆、氯嘧磺隆、烟嘧磺隆的LOD为0.2 μg/kg,氟胺磺隆、苄嘧磺隆、吡嘧磺隆的LOD为0.4 μg/kg,甲磺隆、氯磺隆、氟磺隆LOD为0.5 μg/kg,均低于刘慧慧等[8]用MAX 固相萃取柱净化水产品样品测得的磺酰脲类除草剂的检出限(1 μg/kg),也低于汤凯洁等[25]用苄嘧磺隆分子印迹固相萃取柱测定的大米中烟嘧磺隆、甲磺隆、苯磺隆和苄嘧磺隆的回收率(1.14、1.17、1.29、2.85 μg/kg),表明该SPE柱相比传统的固相萃取柱及分子印迹固相萃取柱,具有更好的检测灵敏度。

表5 平行测试3Table 5 Parallel experiment 3

表6 10种磺酰脲农药的标准线性方程和相关系数rTable 6 Standard linear equations and relative coefficients(r)of 10 sulfonylurea herbicides

注:Y:峰面积;X:质量浓度,μg/kg。

图7 10种磺酰脲农药总离子色谱图(10 ng/mL)Fig.7 Total ion chromatogram of 10 sulfonylurea herbicides(10 ng/mL)注:1:单嘧磺隆;2:噻吩磺隆;3:甲磺隆;4:氯磺隆; 5:烟嘧磺隆;6:苄嘧磺隆;7:氟黄隆; 8:吡嘧磺隆;9:氟胺磺隆;10:氯嘧磺隆。

基于《GB 2763-2016食品中农药最大残留限量》[4]规定的有关粮谷中磺酰脲类除草剂的MRL值及本方法的灵敏度,设定大米样品中的添加水平为10、20和50 μg/kg,每个水平3次重复,添加回收率与相对标准偏差如表7所示。10种磺酰脲类除草剂的平均回收率在79.75%～99.05%之间,相对标准偏差为6.7%～13.8%,满足分析方法的要求。

表7 10种磺酰脲类除草剂在大米中的添加回收结果(n=3)Table 7 Recoveries of 10 kinds of sulfonylurea herbicides in rice samples(n=3)

3 结论

本试验将制备的磺酰脲类除草剂按40 mg MIP与10 mg MOFs混合,以其为填料制成MOFs-MIP固相萃取柱,结合HPLC-MS/MS方法,实现了大米中10种磺酰脲类除草剂的同步快速痕量分析。本研究将MIP和MOFs材料在固相萃取中联用,弥补了传统MIP形状不规则,模板渗漏及MOFs材料选择性差的不足,为大米、粮谷等复杂基质中磺酰脲类除草剂的多残留检测提供了技术支撑。