Box-Behnken响应面法优化秦巴山区粉葛中总异黄酮的提取工艺

,2,3,*,2

(1.陕西科技大学化学化工学院,陕西西安 710021;2.安康学院医学院,陕西安康 725000;3.安康学院秦巴中药资源研发中心,陕西安康 725000)

粉葛为豆科植物甘葛藤(PuerariathomsoniiBenth)的干燥根,载于2015版《中国药典》,具有解肌退热、生津止渴、通经活络、解酒毒等功效,临床主要用于外感发热头痛、项背强痛、口渴等症状[1]。2005年版药典将葛根分为野葛和粉葛,野葛中葛根素含量高于粉葛,而粉葛淀粉含量约是野葛的3倍[2]。粉葛是一种药食两用植物,异黄酮是粉葛的有效成分,具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒等作用,对髙血压、冠心病和糖尿病等心血管类疾病也具有独特疗效[3-7]。粉葛提取物作为原料制备的葛根骨康宁颗粒可以预防中老年骨质疏松[8],粉葛还可以制备葛粉、葛根口服液、葛根饮料等[9-10]。

近几年,国内外学者采用了溶剂法、微波辅助萃取法、酶解法、超临界萃取法等提取葛根中总异黄酮[11-15],对粉葛中总异黄酮的提取工艺的研究未见报道,并且传统方法存在耗时、溶剂使用量大、设备要求高且工业生产成本大等弊端,不利于工业化生产。而超声法具有操作简单、提取时间短、条件温和、提取效率高等优点[16],有利于总异黄酮的提取和产业化生产。

秦巴山区作为葛根的适生地,因其优越的生态环境,产出的野葛质优量大。据文献报道,葛根的储藏量高于600万吨[17],且粉葛引种越来越多,因其开发用途广、效益高、综合开发利用日益受到重视,研究该地区粉葛中总异黄酮的提取工艺对区域特色产业具有十分重要的意义。因此,本文拟采用超声波辅助乙醇法提取粉葛中的总异黄酮,并以总异黄酮提取得率为评价指标,采用响应面法优化其提取工艺,以期为秦巴山区粉葛的资源开发和合理利用提供理论依据和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

粉葛 采自安康市平利县,洗净,除去表面泥沙,晾干,切成薄片,于50 ℃烘箱中烘干、粉碎于干燥器中备用;无水乙醇 天津市天力化学试剂有限公司;葛根素标准品(纯度≥98%) 北京索莱宝科技有限公司。

FW177型中草药粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司;L5S紫外可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司;电子天平 北京赛多丽斯仪器系统有限公司;DK-2000-IIIL型电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司;KH-250DE型超声波清洗器 昆山禾创超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 粉葛中总异黄酮的提取 参考常跃兴[18]的方法,称取粉葛粉末三份,每份约1 g,置于具塞锥形瓶中,精密加入40%乙醇25 mL,称定重量,在55 ℃下,超声辅助提取40 min,冷却至室温,再称定重量,用40%乙醇补足减少的重量,摇匀,过滤,取续滤液,得测定用粉葛总异黄酮提取液。

1.2.2 粉葛总异黄酮含量的测定

1.2.2.1 标准曲线的绘制 精密称取葛根素标准品5.8 mg,于25 mL容量瓶中,用30%乙醇溶解,定容得到232 μg/mL葛根素标准溶液。精密吸取葛根素标准液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于容量瓶中,各加1 mL 30%乙醇,再加蒸馏水定容至10 mL,摇匀即得。在波长250 nm下用紫外分光光度计测定吸光度,再以浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,得到回归方程y=0.07478x-0.0192,R2=0.9994,此方程具有良好的线性关系。

1.2.2.2 粉葛提取液中总异黄酮含量测定 精密吸取1 mL粉葛提取液于25 mL容量瓶中,加入40%乙醇稀释至刻度,摇匀。在250 nm的紫外分光光度计波长下测其吸光度,计算总异黄酮提取得率。

式中:Y为总异黄酮提取得率,%;C为由标准曲线方程所得总异黄酮浓度,μg/mL;V为提取液体积,mL;m为粉葛粉末的质量,g

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 乙醇浓度对粉葛总异黄酮提取得率的影响 称取粉葛粉末,每份约1 g,料液比1∶25,超声功率100 W,超声温度55 ℃,超声时间40 min,乙醇浓度分别为20%、30%、40%、50%、60%的条件下提取总异黄酮,平行做三份,在波长250 nm下测定其吸光度并计算提取得率。

1.2.3.2 料液比对粉葛总异黄酮提取得率的影响 称取粉葛粉末,每份约1 g,乙醇浓度40%,超声功率100 W,超声温度55 ℃,超声时间40 min,料液比分别为1∶15、1∶25、1∶35、1∶45、1∶55条件下提取总异黄酮,平行做三份,在波长250 nm下测定其吸光度并计算提取得率。

1.2.3.3 超声时间对粉葛总异黄酮提取得率的影响 称取粉葛粉末,每份约1 g,乙醇浓度40%,料液比1∶25,超声功率100 W,超声温度55 ℃,超声时间分别为30、40、50、60及70 min条件下提取总异黄酮,平行做三份,在波长250 nm下测定其吸光度并计算提取得率。

1.2.3.4 超声温度对粉葛总异黄酮提取得率的影响 称取粉葛粉末,每份约1 g,乙醇浓度40%,料液比1∶25,超声功率100 W,超声时间40 min,超声温度分别为35、45、55、65及75 ℃条件下提取总异黄酮,平行做三份,在波长250 nm下测定其吸光度并计算提取得率。

1.2.4 响应面试验设计 KH-250DE型超声波清洗器最大功率100 W,所以本文选择超声功率为100 W,超声时间60 min,最终在单因素实验结果的基础上,选择乙醇浓度(A)、料液比(B)、超声温度(C)三个因素为自变量,以粉葛总异黄酮提取得率为评价指标,采用Design-Expert 8.0.6软件进行试验设计和分析,优化粉葛总异黄酮提取工艺。响应面试验因素水平如表1所示。

表1 Box-Behnken试验设计因素水平及编码Table 1 Box-Behnken test design factor levels and codings

1.3 数据处理

采用Design Expert 8.0.6、Origin 8.0等软件对数据进行处理及分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 乙醇浓度对粉葛总异黄酮提取得率的影响 由图1可知,粉葛总异黄酮得率先随乙醇浓度增大而升高,乙醇浓度为40%时,总异黄酮提取得率达到最大,当乙醇浓度高于40%时,总异黄酮提取得率反而降低。这可能是因为乙醇浓度太小,粉葛中异黄酮未完全浸出,而随着乙醇浓度的增大,提取液中除异黄酮外的其他成分也被提取出来,从而影响黄酮类物质的提取,造成粉葛总异黄酮提取得率的下降[19]。因此,适宜的乙醇浓度为40%。

图1 乙醇浓度对粉葛总异黄酮得率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of total isoflavones

2.1.2 料液比对粉葛总异黄酮提取得率的影响 由图2可知,考察了料液比对粉葛总异黄酮提取得率的影响,料液比在1∶15到1∶45这个范围内,粉葛总异黄酮提取得率随着料液比的增大而升高,当料液比1∶45时,总异黄酮提取得率达到最大,当料液比大于1∶45时,总异黄酮提取得率降低。可能是因为料液比太小时,溶剂不能有效浸润样品,无法完全提取出黄酮,因而得率低,而料液比过大时,淀粉大量被吸附导致黄酮溢出受阻。也可能是由于超声波在溶液中传播时,声波能量随着传播距离的增加急速衰减,因而随着固液比的增加,体系中总的溶液体积增大,在距离声源较远的距离处,超声波能量降低,空化能力削弱,不利于黄酮的溶出[20-21]。因此,选用料液比为1∶45是适宜的比例。

图2 料液比对粉葛总异黄酮得率Fig.2 Ratio of material to liquid ratio of total isoflavones

2.1.3 超声时间对粉葛总异黄酮提取得率的影响 由图3可知，在30～60 min这个范围内,总异黄酮提取得率随着时间的延长而增加,当时间超过60 min后,总异黄酮提取得率降低,最佳超声时间为60 min。这可能是因为随着超声时间延长,总异黄酮逐渐溶于乙醇提取液,得率逐渐增大。而超声时间超过60 min,一方面溶剂逸出,另一方面总异黄酮结构可能受到破坏,导致提取得率下降[22-23]。

图3 超声时间对粉葛总异黄酮得率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic time on the yield of total isoflavones

2.1.4 超声温度对粉葛总异黄酮提取得率的影响 由图4可知,随着温度的升高,粉葛总异黄酮提取得率也随着增加,但当温度达到35 ℃后总异黄酮提取得率增加幅度不大,当温度超过45 ℃,粉葛总异黄酮提取得率随着温度的升高而减少。这是因为温度过高,一些热敏性组分破坏或者溶剂挥发导致乙醇浓度降低而使总异黄酮提取得率降低,影响黄酮的提取[24-25]。因此,实验选择45 ℃作为超声温度。

图4 超声温度对粉葛总异黄酮得率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on the yield of total isoflavones

2.2 响应面试验优化葛根总异黄酮提取工艺

2.2.1 响应面试验结果 根据表1的因素和水平进行设计响应面试验,结果见表2。包括 17个试验点,其中12个析因点,5个零点。

表3 粉葛中总异黄酮提取得率为响应值的回归方程方差分析Table 3 Regression equation analysis of variance of total isoflavone extraction rate in powder

表2 Box-Behnken试验设计与结果Table 2 Box-Behnken test design and results

2.2.2 回归模型的建立与显著性分析 采用Design Expert 8.0 实验设计软件对表2中的数据进行回归分析,得出乙醇浓度、料液比、超声温度三个因素与粉葛总异黄酮提取得率之间二次回归方程Y=0.68+0.001225A+0.013B-0.001775C+0.008525AB-0.002025AC+0.002325BC-0.014A2-0.040B2-0.022C2。二次回归拟合后的回归方程方差分析如表3所示。

2.2.3 交互影响显著性分析 根据实验结果绘制出各因素关于粉葛总异黄酮含量的响应面三维图和等高图如图5～图7所示。观察响应面的陡峭程度可以看出,相对于乙醇浓度与超声温度,料液比对粉葛总异黄酮提取得率的影响更大,这与表3分析结果一致。乙醇浓度和料液比，超声温度和料液比等高图接近椭圆,说明各因素的交互影响较为显著。

图5 乙醇浓度和料液比对粉葛总异黄酮 提取得率影响的响应面图(a)和等高线图(b)Fig.5 Response surface diagram(a)and contour plot(b)of the effect of ethanol concentration and solid-liquid ratio on the extraction yield of total isoflavones

图6 乙醇浓度和超声温度对粉葛总异黄酮提取得率影响的响应面图(c)和等高线图(d)Fig.6 Response surface diagram(c)and contour plot(d)of the effects of ethanol concentration and ultrasonic temperature on the extraction yield of total isoflavones

图7 料液比和超声温度对粉葛总异黄酮提取得率影响的响应面图(e)和等高线图(f)Fig.7 Response surface diagram(e)and contour plot(f)of the effect of solid-liquid ratio and ultrasonic temperature on the extraction yield of total isoflavones

从图5～图7中可以看出响应面开口朝下,总异黄酮提取得率随各因素的变化呈先增加后减少的趋势,说明此模型存在最大值的稳定点。对稳定点进行分析,结果如表4所示。

表4 稳定点的规范分析Table 4 Specification analysis of stable points

2.2.4 回归模型的验证 为了检验响应面法所得各优化参数的准确可靠性,对各影响因素的优化值进行验证。考虑到实际操作情况,将最佳条件进行修正,设定为乙醇浓度为41%、料液比1∶47、超声温度45 ℃。在该条件下平行进行3次试验,得到粉葛中总异黄酮的平均提取得率为0.68%,与预测值的相对误差为0.21%,表明该模型有较好的预测性能。

3 结论

本实验采用超声波辅助乙醇提取粉葛中总异黄酮,以葛根素为对照品,采用紫外分光光度法检测总异黄酮含量。通过单因素和响应面法分析优化提取工艺,探讨了乙醇浓度、料液比、超声时间、超声温度对总异黄酮提取得率的影响,通过对稳定点的规范分析得到最优的提取条件:乙醇浓度为41%、料液比1∶47、超声温度45 ℃,在该条件下粉葛中总异黄酮提取得率为0.68%,结果显示实测值与预测值的相对误差仅为0.21%,表明该模型可以很好的优化粉葛总异黄酮的提取工艺条件,可用于粉葛总异黄酮的工业化提取。在考察提取时间中,尽管60 min时提取得率最高,但40～60 min之间变化不大,考虑工业化生产中的能耗和实际,可选择超声时间为40 min。