线粒体DNA拷贝数与胚胎发育潜能的关系

王珺，王茜怡，王晓红

(空军军医大学唐都医院妇产科生殖医学中心，西安 710038)

在人类辅助生殖技术(ART)中，胚胎形态学指标和卵裂率是选择胚胎移植的传统的标准。虽然通过这些方法可以改善体外受精-胚胎移植(IVF-ET)的妊娠结局，但还是有很多移植的胚胎植入失败[1]。通过胚胎植入前非整倍性检测(PGT-A)，选择整倍性的胚胎植入，明显增加了试管婴儿的活产率，但是，选择移植的整倍性胚胎即使植入成功，也并非都能获得持续妊娠[2]，这表明胚胎发育潜能也不能仅通过染色体的状态来评估。动物模型研究表明线粒体与生殖功能密切相关，在人类辅助生殖领域，研究者也越来越多地关注线粒体功能[3-4]。

线粒体通过其关键的细胞功能在胚胎发育和维持胚胎代谢方面起着至关重要的作用。这些功能包括：维持离子稳态、氨基酸代谢、糖酵解、脂肪酸代谢、信号转导、凋亡调节等。早在上世纪70年代，就有哺乳动物卵母细胞线粒体检测的报道[5]。1981年，Anderson等[6]发表了人类线粒体DNA(mtDNA)的序列和结构，为后续的快速发展铺平了道路。在卵母细胞发育早期，卵原细胞包含大约200个线粒体，随着卵母细胞减数分裂，线粒体数量持续增加，排卵中期MⅡ卵达到顶峰，具有10万个线粒体，5～55万mtDNA拷贝。成熟卵母细胞是人类细胞中线粒体含量最高的细胞，这可能是由于在卵母细胞受精和早期胚胎发育中存在着巨大的能量需求[7]。现将卵母细胞受精至胚胎发育过程中，线粒体DNA含量与胚胎发育潜能的关系综述如下。

一、卵母细胞mtDNA含量与胚胎发育潜能的关系

卵母细胞的线粒体水平在生殖中扮演着重要的角色。体细胞中，每个线粒体内含有1～15个mtDNA拷贝[8]，而卵母细胞中，一个线粒体内仅包含1个mtDNA拷贝[5]。休眠在始基卵泡中的卵母细胞只含有不到1万个线粒体[9]，排卵中期MⅡ卵可以达到150万个线粒体[10]。卵母细胞是女性体内最大的细胞，成熟卵母细胞含有较其他体细胞更多的mtDNA[7]。

Reynier等[11]研究显示，mtDNA含量减少可能会引起IVF中卵母细胞体外受精失败。与正常受精的卵母细胞相比，未受精的卵母细胞mtDNA的含量显著降低。采用体外成熟的人类卵母细胞进行研究，结果显示，减数分裂时纺锤体的形成缺失可能导致mtDNA含量低，最终也会导致胚胎质量较差[12]。

有学者最早证实MⅡ卵中mtDNA的含量与女性年龄呈负相关。女性年龄增加会导致卵母细胞mtDNA数量的减少及突变率增加，进而导致其发育潜能降低，因此，提出年龄相关的不孕与卵母细胞发育潜能减弱首要相关[13]。

高龄患者卵母细胞颗粒细胞(CCs)中mtDNA的突变率较高，颗粒细胞中mtDNA含量的评估具有预测胚胎质量的能力[14-15]。有研究发现IVF的女性黄素化颗粒细胞中mtDNA存在高比率缺失[16]，而近期研究则并未检测到任何缺失[17]，这有待于进一步的研究。

二、卵裂期胚胎mtDNA含量与胚胎发育潜能的关系

人类辅助生殖技术中，女性成熟卵母细胞要进行体外受精，不能直接进行有创性分析，因此，对人类胚胎mtDNA的含量与辅助生殖结局的研究逐渐增多。由于mtDNA拷贝数在胚胎发育至囊胚之前并不复制，因此卵裂期mtDNA的含量可反映出受精前卵母细胞mtDNA的含量[18]。受精卵mtDNA的总量将在胚胎发育、细胞分裂过程中不断被稀释，最终形成每个卵裂球mtDNA低拷贝的状态[19]。而且，由于细胞质的体积不同，每个卵裂球含有不同比例的mtDNA[20-21]。

早期研究表明，与形态学评分低的胚胎相比，形态学评分高的卵裂期胚胎mtDNA拷贝数较多[22]。但在相同患者同一枚卵裂期胚胎的不同卵裂球中，却存在较大的差异。不同的细胞质体积可能是形成差异的主要原因[20-23]。

有研究表明，高龄女性胚胎卵裂球中mtDNA水平较低[24]，但也有研究得出了相反的趋势，或至少证实卵裂球中mtDNA含量与年龄并没有相关性，同时也没有发现卵裂球染色体的状态与mtDNA含量的相关性[25-26]。有研究指出卵裂期胚胎mtDNA含量对于胚胎植入潜能具有预测价值[27]。卵裂期胚胎培养液非侵入性分析显示，mtDNA含量与囊胚形成率、胚胎质量、植入潜能显示出正相关性[28]。

三、囊胚mtDNA含量与胚胎发育潜能的关系

2015年，Fragouli等[24]与Diez-Juan等[27]首次提出囊胚滋养外胚层mtDNA含量与胚胎发育潜能的相关性：低mtDNA含量的囊胚，具有高的植入率。非整倍性囊胚与女性高龄囊胚，mtDNA水平较高，植入率较低[24]。“安静胚胎假说”[29]认为：mtDNA含量低的胚胎趋于安静。正常代谢状态下的“安静”囊胚，表现出低的mtDNA拷贝数，有更大的植入潜能；而能量储备不足的胚胎，会打破“安静”状态，应激启动早期线粒体激活和复制的补偿机制来满足卵裂期增加的能量需求，这使得囊胚期mtDNA含量代偿性增加，植入潜能下降。这一假说可能能够解释先前研究者的发现[24-27]。

有学者对35个IVF周期的1 500枚整倍性的囊胚进行了回顾性分析[30]，观察到282枚囊胚中，33枚mtDNA高水平的胚胎均植入失败。研究中有一半的试管婴儿中心并不存在高水平mtDNA含量的囊胚，另一半中心存在高水平mtDNA含量的囊胚，但其囊胚mtDNA水平升高者占比从1%～27%不等。这样宽范围变化的原因尚不清楚，有可能与实验室条件、促排卵刺激方案等相关的ART技术因素有关。

另有一项前瞻性随机对照研究显示[31]，在移植的199枚整倍性囊胚中，57枚植入失败，其中有9枚具有较高的mtDNA水平，且这9枚囊胚无一例成功妊娠。这表明mtDNA评分与囊胚植入潜能之间存在直接的相关性，mtDNA评分至少可以作为一个负向指标，来预测哪些胚胎不易于移植。mtDNA评分或许还可以用于IVF实验室的质量管理，比如，实验室运行条件好，mtDNA评分高的囊胚就少，临床妊娠率就高。

Treff等[32]认为形态学评分高的胚胎确实mtDNA拷贝数低，但在成功植入胚胎与植入失败胚胎中，mtDNA含量体现出相似的水平。作者分析，可能是由于样本量较小或是mtDNA评估方法不同，导致结果无统计学差异。近期大样本回顾性分析[33]同样发现，对于整倍性囊胚的发育潜能，mtDNA的预测价值并无统计学差异，但是非整倍性囊胚确实显示出高水平的mtDNA含量。

近期一项关于1 600多例囊胚的滋养外胚层活检细胞mtDNA研究[34]，发现非整倍性且质量差的囊胚，具有较高mtDNA含量。同时还提出了新的相关性指标，如：BMI是患者唯一的与mtDNA含量呈正相关的指标；促排卵刺激中，血清黄体酮的浓度对mtDNA含量有负向作用，即黄体酮浓度高时，mtDNA含量低，胚胎质量好。

mtDNA检测是否可作为临床胚胎发育潜能的高效预测指标仍然是尚未解决的问题。而胚胎的发育潜能也受到诸多因素的影响，这使得探索研究之路更加复杂。新的研究聚焦于胚胎培养液、颗粒细胞、卵丘细胞等无创性检测。最新的关于胚胎培养液mtDNA的前瞻性、双盲、多中心研究[28]证实：线粒体DNA与核基因组DNA的比值(mtDNA/gDNA)与胚胎质量及发育潜能显著相关。研究认为D3胚胎培养液中mtDNA/gDNA比值可以作为胚胎发育潜能的预测指标，结合形态学评估指标，可使胚胎评估的敏感性与特异性达到92%与65%。这有助于胚胎学家在胚胎形态学评分相同的情况下，选择胚胎发育潜能更好的胚胎植入。

对于胚胎发育潜能的研究即令人兴奋又富有挑战。不断探索无创的、便捷的、客观的生物学指标来评估胚胎发育潜能，是我们下一步努力的方向！