PCR技术在植物生物学中的应用研究

张宝华

（朔州师范高等专科学校，山西朔州 036000）

1 PCR技术原理

PCR指的是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），而PCR技术就是一种将待检验的DNA序列于生物体细胞外在酶促作用下进行扩增的技术方法。对于PCR技术，主要由3个反复循环的步骤构成，也就是高温变性、低温退火以及适温延伸，然后在TaqDAN聚合酶这种特异的耐热酶的催化作用下完成。对于PCR技术的基本原理，是将寡聚核苷酸引物与模板DNA分子结合，然后进行特异核苷酸序列的扩增。

2 PCR技术的主要分类

2.1 多重PCR技术

多重PCR技术是在普通PCR技术的基础上发展起来的，对于多重PCR技术的原理，和PCR技术大致相同，是加入两对及以上的特异性引物在同一个PCR反应体系中，而由于引物能够特异性结合模板DNA，所以在同一模板不同区的多个目的或是多个模板的NDA片段能够扩增出来。对于多重PCR技术，具有低成本、高效率、简单省时等优点，在其基于引物筛选的基础上需要多次优化反应体系和反应条件。

2.2 单分子PCR技术

单分子PCR技术是以单个或者是少量的DNA分子作为模板进行的PCR反应。和传统的PCR技术相比，单分子PCR技术的基本循环过程相同，只不过在模板数量、引物设计、反应条件以及DNA聚合酶的选择等方面，单分子PCR技术与传统PCR技术都不相同。

2.3 实时荧光定量PCR技术

所谓的实时荧光定量PCR技术，是在传统PCR技术的基础上融合核酸扩增、杂交、实时检测以及光谱分析等技术，因此具有准确性高以及实时性的特点。对于PCR技术的研究，实时荧光定量PCR技术是从定性到定量的飞跃。实时荧光定量PCR技术是由美国PE公司于1995年研制成功的，然后将其应用到了植物生物学、分子生物学等各个领域。

3 PCR技术在植物生物学中的应用

3.1 PCR技术在植物抗病基因检测中的应用

随着社会的不断进步，科学技术的不断发展，人们对于植物抗性基因的检测越来越关注，而对于基因的表达量差异，采用传统的诺瑟杂交或者是常规PCR方法，很难将其快速、准确地分析出来，而通过实时荧光定量PCR技术，能够对植物在不同处理条件下基因的表达量差异进行快速、准确的分析。除此之外，对于抗病基因，还能够使用多重PCR技术进行检测。

2005年，李君明等[1]使用多重PCR技术对抗番茄花叶病毒病的Tm 22基因以及番茄抗根结线虫的Mi基因紧密连锁的SCAR标记进行扩增筛选，扩增的特异性片段基本完全吻合待引物扩增片段，然后再通过酶切对感病基因型和杂纯合基因型进行鉴别。多重PCR技术能够在同一个PCR反应中同时筛选鉴定两个抗病基因并早期辅助选育苗期。2012年，陈涛等[2]利用与抗白粉病基因Pm13和Pm21连锁的特异性标记，将含有抗白粉病基因Pm13和Pm21的114株杂交F4代群体随机挑选，进行单一PCR和多重PCR技术检测。检测结果发现具有Pm21特异标记的有5株，具有Pm13特异标记的有4株，同时具有Pm13和Pm21特异标记的有4株，两者具有一致的检测结果。该研究同时表明对于Pm13和Pm21，多重PCR检测能够将含有这两个抗病基因的累加体材料快速、准确地检测出来。2013年，刘超勤等[3]在对抗根结线虫病的Mi基因、抗黄化曲叶病毒病的Ty-1和Ty-2基因以及抗叶霉病Cf-5基因紧密连锁的CAPS标记进行的筛选中，只使用了一次多重PCR技术，然后通过酶切后得到的特异性片段大小与他人的结果基本相同，这表明了多重PCR技术的准确性较高。

3.2 PCR技术在转基因植物检测中的应用

转基因作物面积的增加，虽然解决了人类的温饱问题，但相应的也带来了新的问题，比如对人类健康产生的影响等问题。随着对基因工程认知的逐渐深入，人们对于转基因食品的安全性也越来越重视，因此就需要对转基因植物的定量以及定性检测技术进行加强。PCR定量分析技术能够在不进行电泳的情况下快速、高效地获取转基因成分的准确含量。其中，实时荧光定量PCR技术能够同时在致病菌以及转基因农作物中使用，而多重PCR技术在转基因植物的鉴定中也有着重要的作用。

2002年，Colono等[4]在基于两对引物的PCR技术中对PAT基因和CryIA基因进行同时检测，成功地区分出转基因玉米和非转基因玉米。2006年，王志纯等[5]建立的3种转基因成分以及马铃薯内源PATA基因之间的多重PCR技术，能够特异性地检测马铃薯及其制品转基因成分。2009年，王渭霞等[6]采用琼脂糖凝胶电泳和四重PCR扩增技术对转基因水稻中Bt、NOS、CpTi以及CaMV35S等常用的外源基因进行了快速准确的检测；2013年，邱良焱等[7]将转Bt、Bar基因的双抗稻米作为原料，采用多重PCR检测体系对水稻内源基因SPS和外源基因进行设计，之后利用该体系成功地将原料中全部6条目标基因快速检测出来。

3.3 PCR技术在植物病原物检测中的应用

对于病原物的分离鉴定是十分困难的，尤其是专性寄生菌，另外病原物的毒性表达与环境条件有着较大的影响。对于病原微生物的检测，PCR技术是对某一特定的引物进行选择，然后扩增到相应的DNA片段上。

2010年，谭小勇等[8]建立的三重PCR体系扩增出 615 bp、480 bp 以及 945 bp 的特异性片段能够对香蕉束顶病毒、黄瓜花叶病毒以及香蕉线条病毒进行同时检测，且具有快速、准确的优点。而在2011年，赵芹等[9]以番木瓜环斑病毒、小西葫芦黄花叶病毒以及黄瓜花叶病毒的外壳蛋白基因保守区序列对特异引物进行了设计，然后对单一PCR技术进行优化，建立了同时能够对3种病毒进行检测的多重PCR体系，从而能够快速、准确地对其进行检测。

3.4 PCR技术在植物育种上的应用

随着科学技术的不断发展，PCR技术得到了广泛的应用，育种学家逐渐将PCR技术运用到植物的育种之中。

2003年，冯翠莲等[10]对康乃馨ACC氧化酶基因的反义植物表达载体进行了构建，然后将载体通过农杆菌介导法导入到了康乃馨栽培品之中，获得了3株转基因植株，然后对其进行PCR-Southern和多重PCR检测，对康乃馨ACC氧化酶反义基因整合到康乃馨基因组中进行了证实，得到了插瓶寿命得以延长的康乃馨新品种。除此之外，张晓科[11]在2007年使用现有小麦品质形状基因的分子进行标记，从而建立了3个多重PCR体系，并通过已知形状的品种对其进行验证，而其中多重PCR体系Ⅰ能够运用于一般小麦品质分子的育种，从而使选育材料的整体加工水平得到提高；体系Ⅱ能够运用于强筋小麦品种的选育；体系Ⅲ能够运用于糯小麦或者是淀粉品质的选育。对于各个体系之中的引物，其间并不存在错配以及相互抑制，所以其检测结果具有可靠性。通过使用这3个多重PCR体系，能够使小麦品种的评价以及选育的效率得到有效提高。另外，郑寒等[12]在2009年利用对小麦优质亚基的特异性分子标记构建多重PCR体系，该体系对于这些亚基的鉴定具有成本低、结果可靠等优点。

4 PCR技术在植物生物学研究中的应用前景

采用分子方法对植物进行研究，是近年来植物生物学研究的重要发展阶段，而其中，实时荧光定量PCR技术与多重PCR技术较单一PCR技术具有更大的优越性，能够更为有效、准确地对植物基因进行检测鉴定，因此已经广泛地在植物病理检疫、植物育种以及环境对植物基因的表达影响等方面进行应用。

多重PCR技术是在同一个体系中复合扩增，所以在植物生物学中会存在一定的问题缺陷，比如与非靶序列的结合会产生非特异性扩增或存在多对引物之间的相互抑制等。所以应用多重PCR技术时，应当合理设计引物，对多重PCR体系及其反应条件进行优化从而减少非特异性扩增。除此之外，还有研究者会使用条件完全相同的成熟单一PCR反应，并遵循多重PCR试验引物组合的一般原则，取得了良好的结果，这就有效避免了多重PCR反应体系建立时繁琐的优化试验，也使得多重PCR技术的实际应用范围得到了极大程度的拓展。

随着PCR技术的发展，其他技术与PCR技术的结合也逐渐增多，比如将毛细管电泳技术与多重PCR技术相结合，可以使基因分裂效率以及检测的准确度得到有效的提高；另外四色荧光技术与多重PCR技术的结合能够使检测的灵敏度得到提高，同时缩短检测时间。而随着科学技术的不断发展和生物技术的不断研发，PCR技术也将得到越来越广泛的应用。