HIV病毒库研究进展新探究*

戴文敏 崔媛媛 舒占钧,2,3

1 新疆医科大学，新疆乌鲁木齐市 830000； 2 新疆医科大学第四临床医学院； 3 新疆维吾尔自治区第六人民医院

当今社会经济飞速发展，人们的思想及生活方式都发生了很大的变化，同时也增加了一些疾病发生的风险，艾滋病就是其中之一，它的患病人数正在逐年增加，其死亡率仍令人恐慌，据联合国艾滋病规划署(UNAIDS)估计，截至2017年底，全球现存活HIV/AIDS患者3 690万例，当年新发HIV感染者180万例，有2 170万例正在接受高效联合抗反转录病毒联合治疗[1]。目前全球公认的用于治疗艾滋病的HAART疗法可以达到抑制HIV病毒复制，减少艾滋病毒血症的目的，但感染HIV病毒是终身的，需要长期口服抗病毒药物来控制病情。人们在了解艾滋病毒感染过程方面取得的进展，以及从癌症和基因工程等其他生物医学领域的疫苗开发中获得的见解，推动着艾滋病毒治疗研究的迅速发展。近年来，关于艾滋病的治疗方法研究分别在免疫治疗，基因治疗及新型药物开发等方面都取得了成果，为未来清除HIV病毒库实现艾滋病的功能性治愈做出了一定程度的贡献，本文回顾了如何消除HIV病毒库的最新进展。

1 HIV DNA库对HIV病毒库的意义

目前研究指出越早启动抗逆转录病毒治疗(ART)对降低免疫激活和病毒库大小都有影响，从而产生所谓的功能性缓解。艾滋病毒感染者必须终身坚持抗逆转录病毒治疗，因为潜伏感染的细胞含有转录沉默的整合原病毒，这使它们能够避免免疫检测，这些潜伏感染的细胞中有一部分是具有复制能力的整合前病毒，构成了潜伏的病毒库[2]，广泛存在于感染HIV病毒宿主的各种细胞和组织中。来自非人类灵长类动物(NHP)研究的证据表明，潜伏期在感染后3d内形成，早期发现和治疗可能不足以防止潜伏期的形成。虽然许多类型的细胞被认为是艾滋病毒前病毒宿主，但静息的CD4+T细胞被认为是最主要的细胞类型[3]。在大多数研究中HIV DNA的数量与病毒载量呈正相关，由于HIV DNA整合在宿主基因中使HIV病毒库持续存在[4]。所以精确测定直接定量细胞相关的整合和非整合艾滋病毒DNA，有助于密切监测艾滋病毒的增殖能力。即使病毒被抑制，对于未经治疗的原发性HIV感染，HIV总DNA水平是一个独立的疾病进展预测因子。

虽然关于HIV病毒库大小与HLA基因型之间关系的报道不多见，但研究显示具有HLA保护性的宿主HIV DNA水平基线低，其原因之一是初期感染受到特异性CD4+T细胞的控制，另外归因于抗体依赖细胞介导的细胞毒性可以降低和控制细胞相关HIV DNA的数量。目前人类白细胞抗原(HLA)多态性与HIV病毒库之间的关系尚未完全理清，以后这一领域的更多研究可以为疫苗设计提供相关机制研究，并识别潜在的细胞毒性T淋巴细胞表位。强有力的证据表明[5]，人类无症状复制疱疹病毒科介导免疫激活，并与抗逆转录病毒治疗期间较高水平的艾滋病毒DNA相关。此外，巨细胞病毒的存在与治疗和未治疗个体的HIV DNA水平呈正相关。可能的原因如下[6]：CD4+T细胞活化程度越高，抗原特异性越强，为重新播散HIV病毒库提供了新的靶细胞。细胞因子和趋化因子水平的升高也会刺激炎症和免疫激活。其他病毒的持续存在改变了免疫环境，使艾滋病毒库变得更加多样化，最终影响其衰变。HIV DNA在不同记忆T细胞亚群中的半衰期不同；干细胞样、中央记忆、过度记忆和效应记忆T细胞分别为277、144、133和88个月。一些特殊的细胞亚群，如Th17和T滤泡辅助细胞，在未经治疗的个体和接受长期治疗的个体中对HIV病毒库的持续存在起着重要作用。无论是接受治疗的患者还是未接受治疗的患者，HIV DNA库的组成和发育都是由病毒特征、免疫系统和治疗策略组成的综合机制决定的。所以研究HIV DNA病毒库的大小对促进HIV病毒库的清除有重要意义。

2 HIV病毒库检测方法

最近发现细胞内或血浆中HIV RNA或DNA水平的定量仍然是描述病毒库最常用的测量方法。尽管这些检测方法有效且高通量，但它们无法区分具有复制能力或缺陷的部分，也无法量化感染细胞的数量。病毒生长测定法为能够产生感染性病毒的细胞比例提供了一个较低的界限，但这些测定法费时、昂贵，而且大大低估了具有复制能力的原病毒潜伏库。现有一些新的检测方法可以克服这些问题，总的来说，有以下几种类型，这些检测方法包括[7]：细胞内HIV DNA，细胞相关HIV RNA，超敏血浆病毒血症，病毒生长检测结果检测，诱导HIV RNA，蛋白检测，小鼠过继转移检测。然而，测量病毒库大小的最佳方法仍存在争议，我们要想制定艾滋病治疗战略需依赖于准确和精确地量化剩余艾滋病毒库的规模。目前研究表明通常需要将检测方法组合起来才能更全面地了解病毒库大小。量化艾滋病细胞相关DNA水平的技术具有高通量但明显高估了完整或真实病毒库大小。虽然QVOA方法历来被认为是衡量复制能力病毒库规模的金标准，但该法在实施方面具有挑战性，而且只适用于确定病毒库规模及复制能力的下限。通过测序来量化完整前病毒的数量，似乎是目前对HIV病毒库潜在真实大小的最佳估计，但鉴于它相对较新且耗时耗资，并不适用于大型临床研究的推广。较新的单细胞检测艾滋病毒表达细胞和高通量量化艾滋病毒蛋白水平的方法是有前景的技术，但仍需要去寻求更多实际的验证。所以对于HIV病毒库的检测我们仍需去探索一种快速、高通量的检测方法，实现精准量化具有复制能力的艾滋病毒库的水平以辅助艾滋病治疗。

3 HIV病毒库的消除研究

目前最有希望的消除策略是shock and kill，该法利用药理学试剂将病毒库中可诱发和感染的HIV病毒库休克转化为转录活性，从而通过免疫或治疗机制对其进行检测和消除。由于病毒库的细胞特性，因此，CD4T细胞往往是潜伏期逆转录剂(LRAs)的目标[8]，以寻求清除潜伏病毒，目前，最热的LRAs是非特异性组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)，最近，体外潜伏期逆转研究使用两种药物方案，包括HDACi和蛋白激酶C(PKC)激动剂，已显示协同放大潜伏期逆转，提供有效shock是可以实现的。此外，某些HDACi可能通过抑制细胞因子释放、延时杀死活化的感染CD4+T细胞、受损的CTL功能以及NK细胞的不必要凋亡来抑制免疫反应，它还对B细胞具有免疫调节作用，并抑制初级生发中心反应，所以为促进病毒库的根除对于新的LRAs的研究是必要的。

最初有研究[9]表明T滤泡辅助细胞轮廓的T细胞可以作为淋巴结中主要的病毒细胞群，随后进一步探索了T细胞的功能的极化如何影响其作为病毒库的能力，从而发现调节性T细胞似乎能够作为病毒库，Honeycutt等人使用了一个人源化的骨髓小鼠(MoM)模型，由于宿主动物(NOD/SCID小鼠)不能指出人类T细胞发育，因此只有髓细胞和B细胞被人类细胞系统重组。ART治疗成功抑制了血浆病毒载量，但部分感染母体(33%，n=3)在治疗后出现反弹，基于这一结果，作者估计MoM中受感染的巨噬细胞的半衰期相当短(1.05d，而HIV-1感染的CD4T细胞的半衰期为2.4d)在接受抗逆转录病毒治疗1周后，它们的数量将减少1%，这一结果加强了T细胞作为HIV-1长期抗逆转录病毒治疗的主要宿主细胞群的贡献。有学者假设特异性静息记忆T细胞是最大的潜伏库，他们对急性感染期接受治疗的艾滋病患者的外周血单核细胞(PBMCs)进行了潜伏期逆转研究[10]，构建了一个多价病毒样颗粒(VLP)的配方，作为潜伏期逆转激活载体(ACT-VEC)，他们随访了慢性和儿童队列研究初步数据表明，ACT-VEC用于与HIV感染的CD4T细胞共同培养DC时，可导致HIV RNA的显著转录。所以，ACT-VEC潜在的给药和辅助策略的研究对未来ACT-VEC是否可以作为一种免疫启动策略，促进治疗的杀死方面仍需投入大量精力去研究。

树突状细胞(DC)是一类特殊的抗原呈递细胞，Kristoff[11]及同事报告了一项关于树突状细胞一种亚型的作用的创新研究，在治疗慢性HIV感染抗原出现促炎型极化单核细胞衍生树突状细胞(MDC1)，作者发现巨细胞病毒和HIV抗原刺激的MDC1可以逆转HIV-1在HIV感染的自体CD4T细胞中的潜伏期接受联合抗逆转录病毒治疗(cART)的个人。此外作者还报道了MDC1可以激活细胞毒性T细胞淋巴细胞(CTL)能够杀死HIV感染细胞。这些研究人员使用来自cART个体的原始细胞来创建一个自体成熟DC亚型，作者证明了这两种细胞都能介导新分离CD4+T细胞的潜伏期逆转，并诱导能够在体外清除感染细胞的效应细胞。现有多个报道证明基于DC的艾滋病毒免疫疗法策略[12]，但仍面临很多挑战，关于如何实现足量制备自体DC，体内DC启动的作用也是目前还在TLR7/9激动剂联合试验中探索，MDC1作为免疫疗法是否能克服限制还待新的临床试验结果去证明。

在人类和恒河猴感染HIV/SIV期间，HIV的主要宿主细胞记忆CD4T细胞和巨噬细胞会在脂肪组织中累积。根据病毒的生长结果分析，脂肪细胞中的CD4T细胞被具有复制能力和传染性的病毒潜伏感染，此外，脂肪细胞与CD4T细胞和巨噬细胞相互作用[13]，促进免疫细胞活化和炎症，这可能支持艾滋病毒的持久性。与淋巴组织等其他主要宿主相比，脂肪组织中的病毒复制可能较少，但脂肪潜伏病毒的复制能力和传染性与其他组织相当。由于脂肪组织的普遍性，脂肪细胞与CD4T细胞和巨噬细胞之间的炎症相互作用，以及抗逆转录药物的选择性分布，将受感染的免疫细胞隔离在脂肪库中，可能是艾滋病治疗工作的一大挑战。受感染的CD4T细胞和巨噬细胞在淋巴组织和非淋巴组织中不断迁移，根据组织微环境的不同，艾滋病毒原病毒可以重新启动复制或保持潜在状态。最近，在小鼠肥胖模型脂肪组织中巨噬细胞和T细胞大量积累的开创性报道之后，对脂肪储留免疫细胞的进一步研究提供了强有里的理论基础，即认为这种免疫现象可能对艾滋病毒的发病机制和宿主动力学具有重要意义[14]。早期研究表明，免疫细胞与脂肪细胞之间的相互作用，特别是围生期脂肪细胞，促进免疫激活和脂肪炎症，提示脂肪细胞调控HIV复制的发病机制，拉希德等人[15]表明，艾滋病毒复制移植游离脂肪酸的脂类代谢途径和产生人类感染的CD4T细胞一致，CD4T调节细胞是脂肪组织稳态的重要调节细胞，也是潜在HIV病毒库。Mansfield等人的报告显示，以高脂肪胆固醇和饱和脂肪酸饮食喂养的siv感染恒河猴的疾病进展和死亡增加[16-17]。随着不断对这些代谢途径和免疫调节机制的不断阐明，将其应用于艾滋病毒领域具有革命性意义，有助于加深对病毒复制、潜伏期和病毒库中持续存在的理解，并提出新的治疗方案。

综上所述，要想早日实现艾滋病的功能性治愈，我们必须加深对HIV病毒库的研究，虽然目前的检测手段不能全面评估病毒库的水平，但是我们可以联合使用现阶段的检测手段，基于HIV DNA库，ACT-VEC通路，树突状细胞以及脂肪组织等潜在病毒库的研究对HIV病毒库规模大小、代谢、分布进行评估，以期为未来艾滋病治疗事业做出贡献。