隐孢子虫病诊断方法研究进展

薛念宇，白金洋，陈宇，倪宏波

(黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163000)

隐孢子虫病是由原生动物隐孢子虫引起的，可以感染许多脊椎动物，包括人类[1]，呈全球分布。隐孢子虫感染是通过口服受隐孢子虫卵囊污染的食物、水等发生的，在摄取之后，子孢子从卵囊中释放出来，入侵宿主胃肠道上皮细胞并经历无性发育。紧随其后的是性发育阶段，导致产生潜在的遗传多样性卵囊，这些卵囊在粪便中完全感染。卵囊也可能在从宿主脱落之前“孵化”，导致再次感染和寄生虫负担的指数增加，引发慢性感染，特别是在免疫功能低下的宿主中[2]。感染隐孢子虫的常见症状是急性或慢性腹泻[3]。目前发现的隐孢子虫有40多种[4]，其中几种是在人体内发现的，检出最多的为人隐孢子虫(C.hominis)和微小隐孢子虫(C.parvum)，其他较少发现的虫种有火鸡隐孢子虫(C.meleagridis)、猫隐孢子虫(C.felis)、犬隐孢子虫(C.canis)、泛在隐孢子虫(C.ubiquitum)、兔隐孢子虫(C.cuniculus)、鼠隐孢子虫(C.muris)和旅者隐孢子虫(C.viatorum)[2]。隐孢子虫病对牲畜的生长影响明显，且造成较大的经济和产量损失，目前尚且没有针对隐孢子虫有效的治疗方法[5]。

目前有多种方法应用于隐孢子虫病的诊断，包括病原体显微镜检查、改良抗酸染色法、检测抗原和抗体的免疫学诊断方法、提取DNA进行检测的分子生物学方法等等。

1 病原学诊断方法

1.1 浓缩法镜检

使用光学显微镜检测浓缩后的粪便样本，通过检查粪便中存在的不同化合物(如脂肪和碎屑)之间的密度差异，增加在这些样本中发现寄生虫的可能性。最常见的卵囊浓缩技术是饱和蔗糖溶液中的浮选，乙醚-福尔马林和醋酸-福尔马林梯度沉淀法[6]。为了更好地观察卵囊，建议使用光场显微镜，在光场显微镜下，卵囊呈现半透明，通常为略带粉红色的结构，其内部含有颗粒[7]。饱和蔗糖溶液(牛皮氏溶液)中的浮选是一种简单的离心-浮选法，于1923年发展起来，目的是促进对动物粪便中寄生虫形式的鉴定。这项技术使用高密度的蔗糖溶液来促进原生动物卵囊和球虫卵囊的分离，同时利用离心作为促进碎片沉降的一种方式，使寄生结构波动，以便稍后恢复。在离心-浮选技术中，可以使用另一种溶质，如硫酸锌来促进包囊和卵囊等寄生进化形式的密度梯度和波动。

1.2 染色法镜检

隐孢子虫卵囊较小，其内、外部结构缺乏明显的可见性，可能会造成诊断上的混乱。许多染色技术被用来对粪便涂片进行染色，检测和鉴别诊断隐孢子虫和其他粪便寄生虫[8]。抗酸染色法、吉姆萨染色法、金胺-酚染色法等是检测隐孢子虫最常用的染色方法。吉姆萨染色法是诊断隐孢子虫卵囊的简便染色法，卵囊可以与酵母菌区分开。卵囊染色为淡蓝色，带红色至紫色的小体，可以准确区分出来，但缺点是微弱的颜色对比会导致阅读困难。虽然这项技术可能很耗时，但在重度感染中可以用低倍镜很好地识别卵囊[9]。金胺-酚染色法是一种与抗酸染色法结合的荧光染色法，具有快速、简便、高效等特点。尽管对荧光显微镜要求较高，但酵母菌在这种染色中不会发出荧光。金胺染色的隐孢子虫卵囊看起来像黄色的圆盘，在黑色背景下有一个苍白的光晕，可以有效地识别卵囊。即使粪便不进行浓缩直接涂片，也可以很好地观察到卵囊[10]。

2 免疫学诊断方法

免疫学方法主要用于检测抗原或抗体，主要方法有间接免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫层析检测技术(GICA)等[11，12]。

2.1 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验(ELISA)既可测定抗原，也可以测定抗体，将已知抗原或抗体进行包被，加入待检物(抗原/抗体)，显色后，通过测定吸光值进行定性或定量的检测方法。卵囊检测下限为103～104个/mL，比常规镜检具有更高的敏感性和特异性[13]。该程序在处理前不需要对粪便样本进行浓缩。分光光度读数将消除显微镜检测的主观性。可以方便、快速地检测大量粪便样本，提高了结果的可靠性[14]。近些年ELISA在细菌、病毒、寄生虫等相关疾病方面的应用非常广泛。

2.2 免疫层析检测技术

免疫层析检测技术能在10～15min内提供结果，它被广泛用于美国隐孢子虫病的常规检测[15]，国外已经有一些检测隐孢子虫抗原的商品化的免疫层析检测试纸条，例如 ImmunoCard STAT、Cryptosporidium-Strip、FASTest CRYPTO Strip、Crypto/Giardia Rapid Assay等商业化产品。尽管它们使用方便，但敏感性较差，假阳性率很高，导致许多病例误诊[16]。

2.3 组织学检测

石蜡包埋或福尔马林固定后组织标本的组织学检查可用于某些临床情况，既可用于诊断，也可用于研究隐孢子虫感染的生理病理方面。然而，由于其步骤繁琐和费用昂贵等诸多缺点，不适合常规诊断。

3 分子生物学诊断方法

由于传统的检测方法具有一定的不足，随着科学技术的发展，分子生物学方法被广泛应用于隐孢子虫的临床检测，其中最常用的是聚合酶链式反应(PCR)方法，PCR方法可以对隐孢子虫虫种进行分型。

3.1 巢氏PCR(Nested PCR)

目前巢式PCR方法被广泛用于人类和动物体内隐孢子虫的鉴定。事实证明，巢式PCR比直接PCR更有效，产生的阳性样品更多，并提高了粪便样本中隐孢子虫DNA的扩增灵敏度[17]。巢式PCR使用了两个引物组，因此，如果DNA模板与第一个引物组存在非特异性结合，则第二个引物组不太可能会发生这种情况[12]。

3.2 PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术

PCR-RFLP技术提高了隐孢子虫的诊断率。当使用合适的引物和限制性内切酶时，PCR-RFLP可以灵敏地检测和鉴定隐孢子虫的种类和亚型。该方法是研究隐孢子虫基因型与表型之间的关系，以及隐孢子虫致病机理、毒力和遗传群体结构的分子基础的重要工具[12]。

3.3 荧光定量PCR(q PCR)

q PCR，在正常的PCR反应体系中，加入荧光染料或者在引物中引入探针的一种诊断方法，在扩增的同时产生荧光信号，通过实时监测信号的累积对模板进行定量。与常规PCR相比，定量PCR(q PCR)可以在很大的动态范围内对遗传靶标进行定量。q PCR通常被认为是检测和计数来自不同宿主的粪便样本中隐孢子虫卵囊最灵敏的实验室方法[18]。

过去的二十年中，基于DNA的方法有了显著的发展，成为快速检测隐孢子虫不可或缺的工具。通过PCR可以进行DNA分析，通过测序可以鉴定隐孢子虫的种类。在许多国家，它不仅被用于研究，还在常规检测中广泛应用。目前没有标准化的方案，也没有统一类型的PCR，可根据实际条件和实验目的合理选择适当的方法。迄今为止，还没有隐孢子虫病的有效治疗方法，也没有有效预防的疫苗，因此，预防及早期诊断是控制其感染的最佳方法。