纳米二氧化硅生物毒性的研究进展

刘亚琴综述，曹济民审校

0 引 言

随着纳米技术的飞速发展，纳米材料已广泛应用于各个领域中[1]。纳米二氧化硅(silica nanoparticles, SiNPs)作为目前生产应用最多的纳米材料，其本身具有热稳定性、化学惰性、高亲水性和弱渗透性等独特的理化性质，被广泛应用于抗微生物制剂的开发、食品安全检查、寄生虫诊断、分子探针、生物成像诊断和肿瘤治疗等生物医学领域中[2-10]。人工合成的SiNPs可通过皮肤直接接触、呼吸道吸入、消化道摄入等途径进入相关职业人群和接触人群体内，也可通过生物实验或医疗途径进入动物或人体体内。由于纳米材料(包括SiNPs)本身结构功能的活跃性，纳米材料的生物安全性及纳米毒理学研究对纳米科技的发展和应用显得尤为重要。充分认识SiNPs具体的毒性作用和机制可为将来纳米颗粒的安全性研发提供理论依据。本文从SiNPs在细胞水平和动物整体水平的毒性作用、影响毒性作用的因素和作用机制等方面作一综述，籍以为SiNPs的临床药物的研发及其应用生物安全性提供参考。

1 SiNPs的毒性作用

细胞是机体结构和功能的基本单位。SiNPs对多种细胞都有较明显的毒性作用。在细胞结构方面，SiNPs破坏大鼠心肌细胞系(H9C2细胞)的细胞间隙连接，并通过线粒体途径诱导细胞凋亡，这种毒性作用呈现出剂量和时间依赖性[11]。在细胞功能方面，Guerrero等[12]通过观察SiNPs与急性分离的成年大鼠心肌细胞共培养24 h后发现，SiNPs能降低心肌细胞收缩频率和肌浆网Ca2+-ATP酶的活性，并抑制线粒体膜电位，从而使细胞ATP供应障碍。Kundu等[13]发现SiNPs可诱导HaCaT细胞中的COX-2表达。SiNPs通过作用于肺动脉平滑肌细胞的瞬时感受器电位通道使细胞内游离钙水平明显增高[14]。

SiNPs可通过皮肤、呼吸道和消化道等多个途径进入生物机体，并在多个器官中蓄积，引起相应的生物学效应。Nemmer等[15]通过小鼠腹腔内注射粒径50 nm 的SiNPs，发现可诱导心脏、肝、肺等多种器官内超氧自由基(reactive oxygen species, ROS)升高、炎症发生及DNA损伤，尤其是引起心脏中TNF-α的升高。Chen等[16]观察了SiNPs对不同年龄段大鼠心血管的影响，发现SiNPs可致心肌缺血性损伤、房室传导阻滞、纤维蛋白原浓度和血液黏度增加，且老龄鼠对SiNPs的敏感性比年轻和成年大鼠更高。Duan等[17-19]通过静脉内显微注射，发现SiNPs对斑马鱼胚胎发育过程中的多种器官均有毒性作用，并使斑马鱼器官发育异常，如出现心脏畸形。以上研究说明SiNPs在细胞和整体动物水平均有毒性作用，并且其毒性作用与SiNPs的粒径大小、表面修饰方式及暴露剂量密切相关，也与作用的细胞或生物种类相关。因此明确SiNPs对不同细胞和生物的作用特点和机制，对深入了解SiNPs的生物安全性差异以及如何合理生物利用SiNPs至关重要。

2 SiNPs的毒性作用机制

2.1 氧化应激氧化应激是纳米材料常见的毒性作用机制，也是较为关键的作用路径。SiNPs本身具有高反应性和高生物活性，其通过内吞作用进入细胞后可诱导细胞内ROS升高，导致氧化应激反应和细胞损伤。细胞水平研究表明，SiNPs作用于HaCaT细胞系、神经母细胞瘤细胞系和内皮细胞等多种细胞，使细胞内ROS升高，进一步导致DNA损伤，这种效应并与SiNPs粒径和剂量相关[13, 20-22]；其中在HaCaT细胞中SiNPs作用于ROS介导的上游激酶，使Akt/Src和JAK2的磷酸化激活STAT3信号途径，从而诱导HaCaT细胞中COX-2的表达，并呈现剂量-时间效应。Guo等[23]通过将人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)系与SiNPs共孵育24 h后发现，SiNPs使丙二醛(malondialdehyde, MDA) 、超氧化物羟化酶(superoxide dismutase, SOD)和谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量明显增加，使谷胱甘肽过氧化物酶含量下降；SiNPs可激活核因子E2相关因子2(nuclear factor-E2 related factor 2, Nrf2)介导的抗氧化系统，使Nrf2及其关键下游基因的mRNA表达上调。SiNP在氧化型低密度脂蛋白刺激后可增强其本身的细胞毒性，促进RAW264.7巨噬细胞脂质聚集，从而表现出更明显的细胞毒性[24]。Hozayen等[25]报道，介孔纳米二氧化硅(mesoporous silica nanoparticles, MSN)通过过量产生ROS，抑制抗氧化剂的作用，促进炎症和组织损伤，从而诱导心脏毒性和肺毒性。

Yu等[26]报道，将径粒65nm的SiNPs通过鼠尾静脉注射于小鼠体内，发现SiNPs通过氧化应激途径激活了TGF-β1/Smad3信号通路使肝脏纤维化，并使肝脏组织进一步出现凋亡坏死，这种效应呈现时间依赖性。Wu等[27]通过给大鼠气管滴注径粒15 nm的SiNPs，发现SiNPs可时间和剂量依赖性地致大脑纹状体和海马中ROS明显蓄积，脑组织中H2O2、GSH、SOD和MDA的含量明显增加并出现炎症反应。研究发现，SiNPs通过不同途径进入生物体均可引起多个脏器发生氧化应激反应。

2.2 炎性反应进入生物体的SiNPs可引起炎症反应，炎症可使部分细胞变性、坏死，从而引起生物机体机能发生改变。Guo等[28]通过将SiNPs与Caco-2细胞和HT29-MTX细胞共培养，发现SiNPs可改变这些细胞的营养转运蛋白的表达水平，并引发炎症反应，IL-8和TNFα表达上调；活性氧物质的增加说明炎症的发生与氧化应激有关。吸入性SiNPs使海马神经元炎性因子IL-1β、IL-6和COX-2明显增加，并呈现出系统性炎症[29]。SiNPs诱导斑马鱼产生中性粒细胞介导的心脏炎性改变，同时使心脏收缩标记蛋白肌钙蛋白T表达明显下调，说明SiNPs通过中性粒细胞介导的心脏炎症和收缩蛋白下调，从而使心功能下降[19]。

Guo等[23]通过将HUVECs与SiNPs共孵育24 h后发现，SiNPs使细胞炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1 和 MCP-1上调。Uemura等[30]将SiNPs与RAW264.7细胞系共孵育时，仅表现为TNF-α、IL-6和IL-1β表达增加，细胞内ROS无明显改变，说明SiNPs所引起的炎症反应不仅仅是氧化应激所致，也与信号转导通路的改变有关[31]。Yang等[19]将SiNPs与RAW264.7细胞共孵育后，显示SiNPs通过激活NLRP3炎性小体使细胞分泌炎性因子；同时SiNPs被吞噬进入细胞后进一步促使炎症的发生。以上研究均显示SiNPs可使生物体炎症反应发生的危险性增加，炎症反应是其引发生物毒性的机制之一。

2.3 线粒体损伤线粒体是大多数细胞产生能量的主要场所，也是细胞中活性氧的主要来源，所以线粒体损伤可引起细胞或机体发生功能性障碍。SiNPs可使心肌细胞线粒体膜电位改变，使细胞ATP供应障碍，从而引起心肌细胞功能障碍。Zhang等[32]发现SiNPs与小鼠精母细胞系共孵育后发现，SiNPs使线粒体肿胀，线粒体结构损伤，线粒体嵴出现断裂并逐渐消失，从而使ATP生成障碍，这种效应呈现剂量依赖性。Du等[33]通过气管灌注粒径60 nm的SiNPs，发现心肌细胞形态和超微结构均发生明显异常，并通过线粒体途径激活caspase-3蛋白，导致心肌细胞凋亡。

2.4 DNA损伤作为细胞遗传信息的携带者，DNA损伤必然会引起细胞功能障碍，从而呈现相应的表型。SiNPs通过使细胞骨架紊乱，可直接破坏DNA双链结构，使组蛋白磷酸化，从而使DNA无法正常发挥功能。SiNPs可直接使细胞核结构破坏，从而使细胞发生凋亡[34]。人肠Caco-2细胞系暴露于SiNPs后，虽在细胞核中无明显SiNPs颗粒聚集，但细胞内DNA明显损伤，并呈现出浓度依赖性[35]。SiNPs可通过激活PKC信号通路使细胞停留在G0-G1期，出现异常有丝分裂，并最终发生细胞凋亡。

2.5 其他机制SiNPs可使多种细胞发生内质网应激，从而使细胞发生凋亡。Wu等[36]发现SiNPs能进入肺泡上皮细胞并在其内质网中蓄积，导致细胞形态异常和细胞器损伤；SiNPs暴露增加了两种ER应激标记物BiP和CHOP的表达水平，并使细胞凋亡。SiNPs使LN229细胞内质网应激标记物GRP78、GRP94和DDIT3的水平增加，以及IL1B和COX2基因表达显著上调，说明内质网应激是SiNPs的毒性机制之一[37]，SiNPs也可通过内质网应激途径引起细胞凋亡。Yang等[38]发现，SiNPs可通过影响钾通道而抑制HUVECs活性，但SiNPs影响钾通道的机制尚未完全明确。SiNPs还激活内皮和周皮细胞的自噬活动，减弱细胞黏附分子的表达，干扰内皮细胞稳态，最终抑制血管生成。SiNPs导致年轻成年小鼠的情绪功能障碍和认知功能障碍，并通过ERK激活引起神经退行性病变和突触改变[29]。低剂量SiNPs能使肝出现肉芽肿，并逐渐出现纤维化，并在多个器官(肝、心脏、肺)均出现肥大细胞聚集[39]。

总之，SiNPs的毒性作用机制呈现多样化形式，这在评价SiNPs的毒性作用时需特别注意，以免遗漏有关作用，造成判断失误。

3 影响SiNPs毒性作用的因素

3.1 粒径纳米颗粒粒径是影响其毒性作用的重要因素。Zhou等[40]将4种粒径(15、25、50、100 nm)的SiNPs与HUVECs共孵育后发现，SiNPs引起细胞内ROS升高，粒径越小，ROS升高越明显。将SiNPs通过鼠尾静脉注射入小鼠体内发现，粒径(10、30、50、70、100、300、1000 nm)大小与血小板减少、肝损伤和致死毒性之间呈负相关；但50 nm SiNPs诱导低体温效应最为明显[41]。Lee等[42]发现，20 nm和50 nm两种粒径的SiNPs诱导人内皮细胞发生凋亡途径截然不同，粒径20 nm的SiNPs通过ER应激途径导致细胞凋亡，而50 nm SiNPs通过P13K/AKT/eNOS信号轴诱导细胞自噬从而发生凋亡。此外，SiNPs的粒径影响其是否被皮肤吸收，从而发挥其生物学效应[43]。

3.2 表面修饰SiNPs因为化学性质稳定使得表面易修饰，从而被广泛应用于多个领域中。有研究发现，表面修饰无孔和有孔SiNPs作为载体进行靶向药物转运治疗中具有重要作用[44]。Giovannini等[45]通过稳定性更好的水凝胶SiNPs和普通SiNPs分别作用于人胶质母细胞瘤和小鸡体循环发现，水凝胶SiNPs具有更好的生物相容性，同时并无明显血栓形成或致死情况的发生。非致死颗粒的表面修饰可以在暴露的生物体内的多个器官中产生不同的毒性结果。甘氨酸功能化SiNPs以类似于可溶性甘氨酸的方式影响斑马鱼胚胎死亡率，发现两种SiNPs均可使胚胎大脑、心脏和肝等器官损伤，使得斑马鱼胚胎发育缺陷[46]。

3.3 其他因素SiNPs毒性作用受纳米颗粒结构形态、暴露方式、暴露剂量等多种因素影响。而SiNPs本身有晶体和不定形两种结构，可根据用途经过不同的合成方法合成多种结构。而暴露途径的不同主要作用的器官也略有不同。呼吸道途径主要作用于肺[47]，而通过消化道和静脉注射进入机体主要的靶器官是心脏、肝和脾[26]。

SiNPs毒性作用影响因素繁多，合理设计SiNPs的粒径及表面修饰是安全应用SiNPs的基础，同时应提高生物利用率从而减少暴露剂量。

4 展 望

综合以上毒性作用和作用机制分析发现，SiNPs虽因其结构和效应的特殊性而被广泛应用，MSN甚至被应用于药物载体的研究，但对其生物安全性的评价目前仍不充分，因而不容被忽视。目前针对SiNPs的毒性作用研究，均证实SiNPs可以使生物体的多个系统，如免疫系统、心血管系统、呼吸系统等发生功能紊乱；部分作用机制及影响毒性效应的因素已得到较好的阐释，如SiNPs的粒径大小、所带电荷以及修饰方式均可影响毒性作用。进一步探讨SiNPs毒性作用的靶点，以便为后期更好地防治SiNPs毒性事件的发生提供理论依据。SiNPs通过内吞作用进入细胞的复杂路径及被溶酶体降解的过程还需进一步研究，这可为SiNPs作为纳米药物载体提供详细的药物转运路径，为后期临床应用提供更为精准的方案，同时为是否通过改变纳米颗粒的粒径及修饰方式来找到一个低毒性甚至无毒性的纳米颗粒提供参考，以便更好应用到医疗和日常生活中。