代谢组学在筛选肾移植潜在生物标志物中的应用

马驰宇, 薛 雯综述, 汤冬娥, 戴 勇审校

0 引 言

肾具有维持体内电解质、水、酸碱度平衡，排泄有害物质、调节血压等功能，与人类健康息息相关。终末期肾病患者生活质量会受到严重影响甚至可能危及生命，肾移植手术是目前治疗终末期肾病的最佳方法[1]。我国的肾移植实验开展于20世纪50年代，1960年吴阶平院士开展了我国第1例人体肾移植[2-3]。20世纪70年代末，肾移植作为治疗慢性肾衰竭和尿毒症等终末期肾病的有效方法在我国得到了推广[4]。然而，肾移植仍面临许多挑战，移植肾失功、术后早期肾功能不全和晚期肾功能衰退以及排斥反应等术后并发症严重影响移植肾的存活率[5]。其中以排斥反应最引人注目，对于机体而言移植肾作为外来器官，自然会被免疫系统识别并攻击[6-7]。为方便医师能够及时准确了解患者病情，针对性治疗，临床上需要一种高特异性、敏感性的非侵入的方法用于术后诊断肾功能障碍及排斥反应。目前常用方法包括临床生物化学检测、彩色多普勒超声、免疫抑制剂的血药浓度监测、移植物穿剌组织病理学检查等[8]。但这些方法都有不同程度上的缺点，不能提供足够的敏感性和特异性，且移植物穿刺组织病理学检查是有创性的[9]。人们通过对代谢组的研究发现，当机体受到环境或自身改变影响时，细胞、组织甚至整体的代谢水平会发生变化，打破原本的动态平衡，导致体液中代谢物种类和浓度的改变[10]。这为临床上筛选生物标志物提供了新思路，在疾病诊治，器官移植，药效评价等诸多方面已有广泛应用。

1 代谢组学简介

1.1 代谢组学的概念在基因组学、翻译组学、蛋白组学的研究逐渐成熟以后，科学家将注意力转到了小分子化合物的研究上，代谢组学应运而生，它可以对样本中的小分子物质(相对分子量小于1500)进行大规模分析[11]。其研究手段主要依赖核磁共振或质谱技术。其研究对象是细胞、组织或器官中所有代谢组分的集合。其研究结果可以理解为机体对基因水平、肠道微生物，蛋白酶活动以及内环境改变所作出的最终应答。基因组学和蛋白组学从根源上解释了机体内可能发生的活动及其过程，而代谢组学则直观的告诉我们机体内正在发生或已经发生的活动[12]。

代谢组学的研究方式可分为靶向与非靶向两种。非靶向代谢组学的研究对象是样本中的所有小分子化合物，包含未鉴定的化合物，因此非靶向代谢组学在发现新的差异代谢物方面有不错的效果，并能对差异代谢物进行定性和相对变化的分析。而靶向代谢组学则针对特定代谢物，主要是同非靶向代谢组学联用，针对非靶向代谢组学筛选的差异代谢物，进行定量分析，达到对非靶向代谢组学结果进行验证的目的，同时利用更为详细的数据对代谢模式进行深入研究[13]。

1.2代谢组学临床应用在临床研究中，代谢组学技术已广泛用于疾病的诊断与预后，病理学研究，个性化用药，以及药物疗效评价[14]。比如，利用代谢组学手段，发现了一系列诊断胰岛素抵抗的生物标志物。其中alpha-hydroxybutyrate可用于早期筛选，这项研究结果的发表，说明人类在二型糖尿病发病的监测和预防工作中更进了一步[15-16]。此外，在肿瘤领域也引入了代谢组学技术，对各类肿瘤比如结直肠癌、乳腺癌等的发病机制、早期诊断及治疗产生了推动作用[17-18]。

然而代谢组学的诸多研究中，能够在临床医疗中取得实际应用的却很少。代谢组学研究对样本数量、质量和样本处理技术要求较高，这使得大部分研究都停留在初级阶段，难以发现有效的标志物，且后续需要复杂、完整验证方法才能被用于临床，这个过程较为漫长[19]。美国梅奥诊所测试目录中有关代谢组学检测项目仅有40余项，包括违禁药物检测、疾病诊断等，涉及代谢物不过几十种。例如，对接受尼古丁替代法戒烟治疗的病人监测血清尼古丁、黄麻碱等代谢物的浓度，判定尼古丁替代品的使用剂量；对雌性激素的检测，包括雌醇、雌二醇、雌三醇，用于乳腺癌风险的评估和母婴疾病的诊断，并且在早产诊断方面比传统的临床评估更准确。

2 代谢组学在肾移植中的研究现状

肾具有排泄和重吸收功能，涉及多种物质的生成及平衡，肾功能的稳定决定了人体内环境的稳定，也影响着人体新陈代谢。因此在肾相关研究中引入代谢组学技术是完全可行的。在肾移植领域，已有很多学者以肾移植患者的血清、粪便、尿液等为标本，通过代谢组学的方法对样本进行处理并分析数据，发现了一系列新的潜在小分子诊断标记物。

2.1代谢组学与肾移植急性排斥反应急性排斥反应(acute graft rejection,AR)对移植肾发挥功能具有重大影响，在肾移植术后并发症中属于最常见的，可由感染、间质性肾炎或急性肾小管坏死导致。近些年免疫抑制剂的使用使AR发生得到有效控制，但如果可以在术前发现可能发生急性排斥的患者的代谢特征，则可根据患者免疫状态指导免疫抑制剂的使用，优化治疗方案。Long等[20]对15例肾移植患者进行尿液代谢组学分析，结果显示，苏糖醇、肌醇、乙醇酸、3-羟基异戊酸、十八烷酸和磷酸盐等共14种代谢物在急排组和正常组之间差异具有统计学意义(P<0.05)。Zhao等[21]采用非靶向液相色谱-质谱(liquid chromatography-Mass spectrometry,LC-MS)的代谢组学方法，对11名AR患者和16名非AR患者术前及术后的代谢物进行分析，发现肌酐、犬尿氨酸、多不饱和脂肪酸、磷脂酰胆碱及鞘磷脂等一些代谢物在AR发生时出现了血清浓度的变化。其中犬尿氨酸浓度在非AR组中的增加是一个较为重要的发现，犬尿氨酸由色氨酸的降解形成，是通过吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)加工合成，IDO的表达有助于抑制T细胞增殖并促进免疫耐受，这可能成为为治疗AR的潜在策略。此外，该研究还发现在移植前，AR组的硫酸化类固醇含量较非AR组低。

2.2代谢组学与肾移植状态的监测肾移植术后的肾存活率受多种因素影响，为提高治疗效果保证移植物存活，需对肾移植不同时期患者的代谢产物进行动态监测，因为许多代谢物都可表示肾功能，这有助于在移植肾发生严重损伤之前指导用药修正肾功能。戴勇等[22]利用核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)技术，对不同时期的术后肾功能正常的肾移植患者(术前、术后1 d、术后7 d)做连续的动态监测，并与健康组做对照，鉴定出甘氨酸、肌酸、氧化三甲胺(trimethylamine-N-oxide,TMAO)等共10个代谢物在肾移植不同时期发生显著变化，可推荐为生物标志物，利用偏最小二乘判别模型诊断的敏感性为98.7%，特异性为95.4%。这些代谢物参与了能量、氨基酸、脂质及核苷酸代谢，其中TMAO在多项研究中被检测到，TMAO由肾髓质产生，作用是维持内环境的稳定，它的出现常为了平衡肾应激反应中高浓度的尿素、胍和胍类衍生物，这提示移植肾功能障碍可能由于髓质细胞的损伤[23]。该研究关注患有终末期肾病需要进行肾移植手术治疗的患者，对术前肾功能异常到术后肾功能逐渐稳定的整个治疗过程进行持续监测，其结果为探索肾移植作用机制和临床治疗效果评估作出了基础贡献。

2.3代谢组学与移植肾功能延迟恢复移植物功能延迟恢复(delayed graft function,DGF)的发生率为20%～25%，在术后早期有概率导致近端肾小管上皮细胞丢失影响移植肾功能，出现此症状的患者需要在术后第一周进行透析，大大影响了生活质量。缺血再灌注损伤是导致DGF的一大原因[24]。Kostidis[25]等为了预测患者肾移植功能延迟恢复的持续时间，采用核磁共振光谱(nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR)的方法对90名患者的尿液代谢物进行了长达1年的跟踪监测。研究发现，缬氨酸、对羟基富马酸、富马酸、2-乙基丙烯酸酯、亮氨酸和乳酸等多种代谢物在DGF不同时期的患者中具有显著差异，并通过计算代谢物比例的方式建立诊断模型，得出两组比例即乳酸盐/富马酸盐和支链氨基酸 /焦谷氨酸盐用以预测DGF的持续时间，AUC达到了0.85，具有较高的诊断价值。依托NMR技术的高重现性，这将为临床上监测DGF和指导术后管理提供帮助。

2.4代谢组学与肾缺血/再灌注损伤肾缺血再灌注损伤(renal ischemic reperfusion injury,RIRI)是指由肾缺血和血液灌注恢复后引起的组织、细胞功能破坏，并伴随代谢异常的现象[26]。发病时，可能出现氧自由基大量生成，钙离子浓度上升，炎症因子的激活等现象，这些最终会导致移植物功能障碍[27]。Serkova等[28]基于NMR技术对中度和重度RIRI的代谢组学研究发现，尿囊素和TMAO的浓度随RIRI程度加深上升，两者之间呈正相关，尿囊素是氧化应激反应的标志物，而TMAO是髓质损伤的标志物，这与RIRI发生的机制不谋而合，提示尿囊素和TMAO作为生物标志物在监测RIRI方面有较大潜力。TMAO的发现也再一次印证了RIRI与DGF相关。基于这些研究基础，Fuller[29]等探讨了N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)预处理对于RIRI的影响，结果显示，NAC预处理组的尿囊素和TMAO浓度显著降低，这预示NAC治疗可能通过改善游离氧自由基的有害作用来改善RIRI。

2.5代谢组学与免疫抑制剂应用终末期肾病的患者在进行肾移植手术后，需要使用免疫抑制剂来抑制免疫系统对移植肾的攻击。然而免疫抑制剂也存在着副作用，因此在免疫治疗时，免疫抑制剂的用法用量显得非常重要。临床上往往采用联合用药的方式，发挥多种药物抑制排斥反应的协同作用的同时，降低单一药物的副作用[30]。在治疗过程中，如果免疫抑制剂使用不足，会导致机体发生排斥反应，若使用过量，又会引起不良反应，加之个体对免疫抑制剂的反应不尽相同，急需建立一种评价免疫抑制剂效果的方法，准确设计及调整免疫抑制剂的使用方案。Xia等[31]利用靶向代谢组学技术，对使用他克莫司进行免疫治疗的肾移植患者尿液样本中的代谢物进行定量分析研究，认为对称二甲基精氨酸(symmetricdimethylarginine,SDMA)和丝氨酸(Ser)的变化可用来诊断因他克莫司肾毒性引起的肾损伤。该研究首次对尿液中的氨基酸和生物胺进行靶向代谢组学定量分析，深入研究，其结果揭示了他克莫司肾毒性对肾过滤负荷、肾小管重吸收和尿量的影响。同时，临床尿液样本具有收集方便、无创、可重复性强等特点，因此对尿液代谢物的深入研究相对更容易开展并普及。

3 结语与展望

接受肾移植手术的患者，由于在手术过程中可能会受到不同程度的器官功能受损，导致术后产生一定程度的代谢紊乱，加之术后免疫系统的复杂反应和免疫抑制剂的长期使用，使得术后机体生理状态复杂，且有患术后并发症的风险存在，单一的生物标志物或传统的临床检验指标很难对移植肾的功能、状态做出及时准确的判断。由于代谢组学检测的高敏感性和特异性，在生物标志物的筛选和诊断模型的建立上具有独特的优势，为肾移植术后早期诊断及移植物监测带来了新的契机[32]。

现在，质谱技术的普及为临床应用打下了基础，统计软件的优化及生物信息学的发展为处理和分析庞大的代谢组学数据提供了支撑，不断丰富的代谢组数据库和不断先进的代谢组学技术，拓宽了代谢组学的影响范围，加深了代谢组学的研究层次[33]。代谢组学方法在应用时如能与上游的基因组学、转录组学、蛋白组学以及影响人类代谢及健康的肠道微生物组进行关联分析，将在疾病机制的研究中发挥巨大的作用。