百草枯中毒致肺纤维化临床治疗及分子机制研究进展

李辞茹综述，聂时南审校

0 引 言

百草枯中毒造成机体损伤的分子机制尚无完全明确，目前认为主要参与体内细胞氧化还原反应，形成大量活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)及过氧化物离子，引起组织细胞膜脂质过氧化，导致多器官功能不全或死亡[1-2]。因肺组织对百草枯的主动摄取和蓄积特性，靶器官为肺，严重损伤肺泡上皮细胞，从而肺表面活性物质生成减少，患者逐渐出现不可逆性肺纤维化和呼吸衰竭，最终死于顽固性低氧血症。此外，百草枯已被证明会使炎症反应基因表达水平升高，如白细胞介素(interleukin，IL)-1、IL-6、IL-8，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)TNF-α、TNF-β，干扰素(interferon，IF)-1，转化生长因子(transforming growth factor，TGF)TGF-β和核因子(nuclear factor,NF)-κβ，同时促炎因子又可以诱导ROS形成[3-5]。

目前百草枯中毒没有针对性的解毒剂，通常采取综合治疗，例如通过洗胃和血液净化来减少毒物吸收，给予糖皮质激素和免疫抑制剂等治疗以减轻肺损伤和晚期的纤维化，同时给予对症支持治疗。然而，这些治疗手段均不是特异性的有效治疗策略且有一定的不良反应。因而探寻百草枯中毒所致肺纤维化的早期治疗和分子机制研究对寻找新的治疗手段和方法，以期帮助改善患者预后、降低死亡率，是临床迫切需要解决的问题[6- 7]。

1 百草枯中毒致肺纤维化临床治疗研究

近年来，临床医师为了治疗百草枯中毒患者的肺纤维化，采用了血液净化技术及多种药物并进行了相关的研究，主要有以下几种：

1.1 血液净化治疗血液净化技术根据治疗时间分为连续血液净化和常规的间断血液净化，包括血液透析、血液滤过、血液透析滤过、血液灌流、血浆置换及免疫吸附等。田英平等[8]回顾性分析了113例急性百草枯中毒患者病历资料，就血液净化治疗方面筛选出57例患者(洗胃时间与服毒量无统计学差异)，其中33例患者在中毒8h内行血液灌流(hemoperfusion，HP)联合血液透析治疗， 1次/d，2～4 h/次，连续5 d，存活例数为22例；另外24例患者在中毒24 h行血液灌流+血液透析治疗，存活例数仅为3例。表明血液净化的时机是很重要的，而且尽早应用血液净化效果越好。黄昌保等[9]进行了一项前瞻性单中心随机对照研究，纳入119例急性百草枯中毒患者，分成连续性静脉-静脉血液净化 (continuous veno-venous blood purification，CVVH)治疗组和常规治疗组，发现CVVH组患者肾损伤、低氧血症及多器官功能衰竭发生率较常规组低，以及CVVH组行CVVH次数和时间长短与急性百草枯中毒患者预后无明显线性关系。Koo等[10]评估了预防性CVVH对急性百草枯中毒患者的疗效，纳入80例中毒患者，中毒24 h内行HP治疗，继而分为HP组和HP-CVVH组，最后发现HP后的预防性CVVH可以预防百草枯中毒患者循环衰竭导致的早期死亡并延长生存时间，但不能预防呼吸衰竭引起的晚期死亡。兰超等[11]综合评价了血液灌流联合CVVH治疗急性百草枯中毒患者的疗效，纳入21篇文献，包括随机对照临床试验、队列研究及病例分析等，最后发现血液灌流联合CVVH较单独血液灌流治疗百草枯中毒，可以明显延长患者生存时间，降低急性呼吸窘迫综征及多器官功能衰竭发生率。

1.2 抗氧化剂Schapochnik等[12]发现维生素D能减少百草枯中毒致肺纤维化小鼠支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中的白细胞数量，降低百草枯中毒小鼠纤维化肺组织中IL-6、IL-17、TGF-β和基质释放金属蛋白酶-9(matrix releasing metalloproteinase-9，MMP-9)水平以及减轻胶原沉积。表明维生素D能减弱促炎因子白介素分泌、TGF-β促纤维化，减少胶原沉积和MMP-9，二者能破坏动物的肺组织结构。同时，使用维生素D治疗后，BALF中的resolvin D水平升高，促进炎症消退和组织修复，而且降低了气道高反应性[13]。提示维生素D治疗百草枯中毒致肺纤维化有潜在疗效，但还有待临床研究进一步证实[14]。另外，N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)是一种常用的抗氧化剂，NAC在细胞内脱去N-乙酰基，形成L-半胱氨酸，参与合成谷胱甘肽，发挥抗氧化作用。体外实验表明，予PQ染毒大鼠NAC治疗，显微镜下观察凋亡细胞，NAC治疗组较PQ组肺组织细胞凋亡率明显下降，表明NAC抑制PQ中毒大鼠肺组织细胞凋亡[15-16]。目前尚无NAC用于PQ中毒致肺纤维化的临床报道。

1.3 糖皮质激素及免疫抑制剂糖皮质激素及环磷酰胺具有强大的免疫抑制作用，是临床上使用最为广泛而有效的抗炎和免疫抑制剂。Gao等[17]发现冲击疗法联合长期低剂量环磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)治疗会减轻大鼠肺损伤，百草枯中毒小鼠肺组织病理改变中，冲击疗法联合长期低剂量CTX组与冲击疗法组、百草枯组相比，其肺泡间隔炎症细胞浸润程度和肺泡壁厚度明显减少[18]。王文生等[19]进行了一项回顾性分析，纳入PQ中毒患者55例，分为大剂量甲泼尼龙联合环磷酰胺组、常规治疗组，比较两组患者I型呼吸衰竭、低氧血症、急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)、机械通气的发生例数，以及胸部影像学表现，发现免疫抑制剂治疗组发生低氧血症、ARDS及机械通气的例数，以及入院后发生多器官功能衰竭例数低于常规治疗组，胸部影像学表现前者较后者肺部磨玻璃阴影、纤维条索等减少，两组比较差异有统计学意义，表明大剂量甲泼尼龙联合环磷酰胺治疗PQ中毒有一定疗效，但具体使用时间和剂量等还有待大样本临床研究进一步证实。

另外，有研究人员综合评价了免疫抑制剂对PQ中毒患者MODS发生率的影响，排除后纳入3项随机对照试验、5项非随机对照试验和2项前瞻性研究，发现免疫抑制剂组PQ中毒患者MODS发生率较对照组低，提示使用免疫抑制剂治疗可以降低PQ中毒患者MODS发生率。另外还发现，在使用环磷酰胺剂量为15 mg/(kg·d)及糖皮质激素或环磷酰胺使用时间为2d时，百草枯中毒患者病死率明显降低，有待进一步大规模临床研究证实，值得关注的是，该发现与急性百草枯诊治专家共识(2013)有共同之处，同时有一定进展[20-21]。

1.4 中药治疗Chen等[22]发现雷公藤内酯醇(triptolide,TPL)，一种中药提取物，通过抑制肺上皮细胞的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)发挥抗肺纤维化作用。体外实验表明，百草枯组纤维细胞标记物波形蛋白发生上调，上皮细胞标记物E钙粘素(E-cadherin，E-cad)下调。然而，由百草枯引起的这些变化可以被TPL逆转，雷公藤内酯醇直接与TGF-β结合，随后增加E-cadherin的表达并降低体内薄荷素表达。在体内实验中，TPL改善了小鼠的存活状态并抑制了肺纤维化。表明TPL对PQ中毒致肺纤维化有潜在治疗作用[23-24]。目前尚无雷公藤应用于PQ中毒致肺纤维化的临床研究。Shen等[25]建立PQ中毒小鼠模型，分为高剂量氯喹组、对照组，体内实验表明，高剂量氯喹组中发现氯喹显著减轻百草枯诱导的肺损伤。百草枯诱导的炎症反应被氯喹抑制，如白细胞数量减少，TNF-α、IL-1β和IL-6水平降低。支气管肺泡灌洗液中，一氧化氮含量降低，肺内一氧化氮合酶表达下调。此外，氯喹治疗组抗氧化酶SOD活性增强，肺组织中过氧化物丙二醛的水平下降。同时，抗氧化蛋白(nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2)的表达也上调。马松染色的结果表明，氯喹显著减轻了百草枯诱导的肺纤维化。免疫组织化学染色显示，促纤维化蛋白TGF-β和α-SMA的表达下调。表明氯喹有效地抑制了百草枯诱导的小鼠肺损伤[26]。但目前尚无临床研究证明氯喹治疗PQ中毒致肺纤维化的作用。

1.5 其 他He等[27]系统评价并分析了11项间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)治疗百草枯中毒动物模型临床前研究，综合生存率、肺干重/湿重、纤维化评分、氧化应激反应、炎症反应，来评估 MSC治疗疗效。其中大多数表示，MSC治疗可提高生存率并降低肺湿/干重、减轻组织病理学纤维化改变。MSC组在急性期后7和14 d，血丙二醛水平下降，同时血超氧化物歧化酶和谷胱甘肽水平升高；血液或肺组织中的IL-1β，TNF-α和TGF-β1水平均有不同程度降低。提示MSCs对PQ中毒致肺损伤小鼠有减轻肺纤维化作用，可能与减少氧化应激和炎性细胞因子水平有关。表明MSC在PQ中毒方面有潜在治疗作用，并有助于增加临床研究的基本原理。

2 百草枯中毒致肺纤维化分子机制研究进展

由于目前治疗措施的乏善可陈，故而对百草枯中毒所致的肺纤维化的分子机制的研究，也一直是百草枯中毒基础研究的热点，近年来的研究主要包括以下几个方面：

2.1 Wnt/β-catenin信号通路研究表明，β-连环蛋白(β-catenin)是Wnt通路的关键分子，MMP蛋白是肺纤维化的标记物之一。黄晶等[28]通过建立百草枯诱导大鼠肺纤维化模型，发现应用蛋白芯片技术检测百草枯中毒组大鼠肺组织中蛋白表达水平及细胞因子水平，结果显示：百草枯肺损伤大鼠肺组织内 IL-1β、β-catenin、TGF-β1 和MMP-2等细胞因子表达水平显著升高。初步证实百草枯中毒后Wnt 信号通路被激活。Western-blot结果显示：与对照组比较，百草枯组β-catenin、MMP表达水平升高，抑制剂组降低，与百草枯组比较，抑制剂组β-catenin、MMP 表达水平降低。结合百草枯大鼠肺组织大体标本、苏木精-伊红染色及马松染色结果提示:与百草枯中毒组相比，抑制剂组肺组织质地软、更红润，结构破坏较少，胶原蛋白沉积减少，肺泡间质纤维化程度降低，证实抑制Wnt 信号通路可以减轻百草枯诱导的肺纤维化[29]。

2.2 肺上皮细胞的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)EMT是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞，这种转变赋予上皮细胞侵袭性，在组织重塑、肿瘤转移、肺纤维化中发生EMT的细胞失去了E-钙粘蛋白和上皮细胞连接组成部分，细胞产生间充质细胞骨架且具备运动性和侵入性[30-31]。Chen等[32]发现PQ中毒肺纤维化小鼠伴有EMT发生。TPL减轻了百草枯诱导的小鼠肺纤维化，表现为小鼠肺泡组织和人正常肺上皮细胞中EMT表型表达水平降低。进一步验证发现TPL结合TGF-β1并抑制后者下游转导的SMAD信号通路，表明百草枯通过激活TGF-β1诱发了EMT，并随后导致肺纤维化。

2.3 NF-κB信号通路Yang等[33]发现敲除Angptl2能抑制NF-κB信号途径介导的炎症、氧化应激和纤维化过程，减轻百草枯诱导的小鼠肺损伤。组织学改变证明，Angptl2缺失能抑制百草枯诱导的肺损伤，可能与抑制NF-κB信号途径从而减轻炎症，氧化应激和纤维化有关。提高NF-κB信号途径活性可以减弱Angptl2缺失的作用，表明Angptl2调节百草枯诱导的肺损伤依赖于NF-κB信号通路的激活。在百草枯处理的细胞中，敲除Angptl2能减轻氧化应激、炎症反应及TGF-β1表达降低，然而，使用抑制剂阻断NF-κB信号通路活化会得到相反的结果。由于炎症反应与氧化应激之间可能存在循环关系，还有待进一步研究以深入揭示Angptl2调节PQ中毒致肺损伤发生发展的潜在机制。

2.4 Akt-Nrf-2信号通路Li等[34]发现，二萜银杏内酯葡甲胺注射液(diterpenoid ginkgolide meglumine,DGMI)可以减轻百草枯诱导的大鼠肺纤维化，结果显示DGMI的给药能增加百草枯组大鼠的存活率。和百草枯组相比，DGMI组大鼠肺组织中丙二醛、IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低及SOD水平升高。苏木精-伊红染色和马松染色显示DGMI减轻组织学损伤，免疫组织化学染色显示DGIM组较PQ组肺组织中Akt、Nrf-2表达增加，提示DGMI改善肺损伤及纤维化可能与其激活Akt-Nrf-2通路有关，具体分子机制有待进一步研究。

3 结 语

综上所述，随着对百草枯中毒致肺纤维化分子机制深入研究，目前其发病机制研究虽然已取得部分进展，但具体潜在分子机制还未完全阐明。对于百草枯中毒的早期临床治疗，目前出现了一些治疗方案，对改善百草枯中毒患者预后有一定疗效，但特效且针对性的治疗还未发现，仍在前期探寻阶段。透彻认识百草枯中毒所致肺纤维化的发病机制，并针对性指导早期临床治疗，还需要基础实验科研人员及医学工作者们共同深入探索。