胖大海润喉丸治疗大鼠口腔溃疡的实验研究

喜鹏

（甘肃省定西市第二人民医院，甘肃 定西）

0 引言

口腔溃疡（recurrent oral ulcer，ROU）是口腔黏膜病中的常见病症，发病率很高，其发病特点为在局部形成溃疡后可继发感染，造成溃疡局部组织炎症和坏死。口腔溃疡病因复杂，可能是多种因素综合作用的结果[1-2]，其确切的发病机制仍处于研究之中，目前尚无较好的治疗方法，尤其是相关中医药防治研究尤为薄弱。本研究选用的胖大海润喉丸由胖大海、桔梗、木蝴蝶、菊花、马勃5 味药材组成，具有疏风清热、解毒利咽之功效。本研究通过观察胖大海润喉丸对大鼠口腔溃疡面积、炎症因子IL-6、TNF-α 水平及α-SMA、FGF1 蛋白表达含量的研究，以期探讨胖大海润喉丸在ROU 治疗中可能的作用机制和临床应用价值。

1 材料

1.1 实验动物

6-8 周SPF 级 SD 大鼠，50 只，体质量 180～220g，雄性，购于甘肃中医药大学定西校区科研实验中心动物培育中心，合格证号为 SCXK（甘）2008-0010。

1.2 药品及试剂

胖大海润喉丸（甘药制字，批号 Z0401082）；IL-6 试剂盒（Peprotech 公司 ）；TNF-α 试剂盒（Peprotech 公司）；冰醋酸（索莱宝公司）；RIPA 美国 Beyotime 公司 P0013C；蛋白酶抑制剂混合物 I AppliChem 公司 A77060001；

BCA 蛋白定量浓度测定试剂盒北京索莱宝公司YG0134；兔抗人α-SMA 多克隆抗体 Immunollay 公司YT0883；兔抗人FAP多克隆抗体Immunollay 公司YT0845；兔抗人 GAPDH 多克隆抗体 杭州贤至生物公司。

1.3 仪器

连续波长酶标仪（美国 BIO-RAD 公司）；游标卡尺（碧云天公司）；低温高速离心机（德国Eppendorf 公司）；蛋白核酸凝胶电泳转印系统 美国 BIO-RAD 公司；电泳仪 （德国Eppendorf 公司）；凝胶成像分析系统 美国 UVP 公司 ；电子分析天平 日本 Shimadzu 公司。

2 方法

2.1 实验分组

SD 大鼠50 只，随机分为空白对照组，模型组，胖大海润喉丸10、30、90mg/kg 组（中剂量为临床等效剂量），每组10 只。

2.2 大鼠口腔溃疡模型的制备

参考文献方法[3-4]并结合本实验室前期建立的方法制备大鼠口腔溃疡模型；将大鼠用10%水合氯醛（3mL/kg）ip 麻醉，于大鼠口腔左侧颊部黏膜下注射10%醋酸，0.1mL/只，对照组注射等量的生理盐水，24h 后可形成口腔溃疡。

2.3 胖大海润喉丸对大鼠口腔溃疡的治疗作

造模成功后第2 天开始给药，将胖大海润喉丸研磨成粉，给药时将药粉（每只大鼠剂量的1/4）均匀涂于溃疡面上，剩余药粉（每只大鼠剂量的3/4）以水溶解后给大鼠灌胃。空白对照组给予等量生理盐水处理，连续给药12d。各组大鼠于末次测量后，处死一起测定相关指标。

2.3.1 测量大鼠口腔溃疡面积的影响

用游标卡尺测量各组大鼠给药前及给药后第4、8、12 天的口腔溃疡的最大横径（d1）及最大纵径（d2），计算疡面积（溃疡面积＝π×d1×d2×1/4，π 取值 3.14）。

2.3.2 ELISA 法测定血清中IL-6 及TNF-α 含量

取离心后血清，用 ELISA 法，严格按试剂盒说明，检测患 者血 清 中 IL-6、TNF-α 的 含量( ng·L-1)。

2.3.3 Western blot 检测溃疡组织α-SMA、FGF1 蛋白的表达

提取各溃疡组织蛋白并定量。各组取20 μg 蛋白上样，经电泳，转膜，封闭后，4℃分别与一抗α-SMA（1：1000）、FGF1（1：1000）及GAPDH（1：500）蛋白相结合，摇床过夜；次日分别与山羊抗兔辣根酶标记的二抗（l：5000）结合反应，ECL 发光显色后，凝胶成像系统曝光检测，并采用Quantity One 4.6.2 软件对图像进行灰度分析，以GAPDH 作内参，结果将目的蛋白条带与内参GAPDH 条带的比值作为参照。

2.4 统计学处理

3 结果

3.1 对大鼠口腔溃疡面积的影响

观察各组大鼠口腔溃疡面的大体形态，结果显示无溃疡出现。注射醋酸后可出现明显的口腔溃疡，肉眼观察溃疡面的黏膜呈凹陷性缺损，大致呈圆形，表面为黄白色，周围充血水肿，说明口腔溃疡模型制备成功。

大鼠口腔溃疡模型呈现一定自愈性，随着时间的延长，溃疡面积逐渐减小。实验开始时各组大鼠口腔溃疡面积无显著性差异；在给药第 4、8、12 天，与模型组比较，高剂量清咽滴丸组大鼠口腔溃疡面积均显著减小，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表 1。

表1 清咽滴丸对大鼠口腔溃疡面积的影响, n=10)

表1 清咽滴丸对大鼠口腔溃疡面积的影响, n=10)

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，与模型组比较，#P＜0.05

组别 溃疡面积给药前 给药第4 天 给药第8 天 给药第12 天空白对照组 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0模型组 28.8±6.4* 26.2±5.4* 16.1±3.2* 8.8±2.1*胖大海低剂量组 27.3±4.8*# 23.5± 3.5*# 14.7±4.3*# 8.0±1.7*胖大海中剂量组 27.2±4.2*# 22.4 ± 3.3*# 15.0±5.5*# 7.3±2.3*#胖大海高剂量组 28.1± 6.0* 14.6± 4.0*# 9.5±4.2*# 4.5±2.2*#

3.2 胖大海对大鼠血清中IL-6、TNF-α 水平的影响

与空白对照组比较，模型组大鼠口腔溃疡组织中IL-6、TNF-α 水平显著升高（P＜0.05），说明模型组大鼠出现炎症反应。与模型组比较，中、高剂量胖大海润喉滴丸组大鼠口腔溃疡组织中IL-6、TNF-α 水平显著降低（P＜0.05），结果见表2。

3.3 胖大海对大鼠口腔溃疡部位组织中α-SMA、FGF1 水平的影响

结果显示（图11 和表6），与正常组比较，模型组α-SMA、FGF1 蛋白表达均显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，各胖大海干预组α-SMA、FGF1 蛋白表达均升高，其中胖大海高剂量组升高最显著，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 各组大鼠血清及IL-6 及TNF-a 水平水平比较

表2 各组大鼠血清及IL-6 及TNF-a 水平水平比较

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，与模型组比较，#P＜0.05

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A：BMSCs 组；B: L-6 100ng/mL+50ng/mL 组;C:黄芪多糖干预

表3 胖大海对大鼠口腔溃疡部位组织中α-SMA、FGF1 水平的影响

4 讨论

口腔溃疡俗称“口疮”，是一种常见的发生于口腔黏膜的溃疡性损伤病症，发作时疼痛剧烈，局部灼痛明显，严重者还会影响饮食及语言交流。ROU 是口腔临床常见多发病，占口腔溃疡的90%以上，反复发作，给患者带来极大困扰，严重影响患者生活质量。近来中医药对ROU 的治疗已经取得了突破性的进展。陈卓等[5]研究发现清咽滴丸（方中有胖大海、桔梗、栀子、薄荷）可通过抑制口腔溃疡大鼠TNF-α 水平，减轻大鼠口腔溃疡面积来加速大鼠口腔溃疡的愈合。我院制备的胖大海润喉丸由胖大海、桔梗、木蝴蝶、菊花等加工提炼而成，胖大海，味甘，凉，性寒。能清肺化痰，利咽开音，润肠通便，为治疗咽喉肿痛之要药；桔梗，味辛、性平，宣肺，利咽，祛痰之功效，对口腔溃疡有很好的疗效；木蝴蝶，具有润肺利咽的作用；菊花，甘苦，性微寒，具有疏散风热、清肝明目、清热解毒的作用。马勃，其性味辛平，有清肺利咽，止血之功效。上述药配伍配伍，活血通脉而化瘀，防止瘀血内停，清血分实热，散瘀血留滞；同时全方兼有清热解毒，凉血敛疮的功效，配伍具有清而不寒，散而不滞的特点，从而达到防治口腔溃疡的效果。

众所周知炎症因子与复发性口腔溃病的发生发展预后呈相关性，患者无论是渍病组织还是外周血中，都检测到炎性细胞因子有异常增高或降低的趋势。细胞因子中TNF-a 及IL-6 均是具有多种生物活性的，由免疫细胞合成分泌的多肽类因子，它们能调节多种细胞生理功能，在机体炎症、免疫应答、急性反应中起着非常重要的调控作用。IL-6 作为一种多效促炎的细胞因子，由B 淋巴细胞、单核细胞、以及部分肿瘤细胞分泌而成，它参与炎症以及免疫反应的多功能炎性因子。IL-6 常通过各种途径促进与参与口腔溃疡的发生发展[6]。Ambrosch A 等[7]认为无论是否存在细菌伤口IL-6 的水平都可作为有用的评估馈痕性炎症敏感性和特异性的血清学标志物。还有人认为虽然复发性口腔溃病的治疗效果可以通过口腔淸痕数目，间隔时间和发生的频率评估，也可以监测血清IL-6 水平来评价药物的治疗效果[8]。TNF-a 主要由单核巨唆细胞产生的细胞因子，可诱导包括自身在内的多种细胞因子以及一些炎症介质的产生，损伤组织，继而加重炎症反应[9]。张琳[10]等用双抗体夹心法研究在复发性口腔淸荡患者中TNF-a 的变化及临床意义，发现复发性口腔渍荡患者血清中TNF-a 的含量可明显增高，提示参与了其病理过程。姜军松[11]等釆用结晶紫染色法探讨肿瘤坏死因子与复发性口掩的关系，以细胞作为革细胞，对复发性口腔溃荡活动期与缓解期患者及口腔粘膜外伤患者的外周血单个核细胞分泌的水平进行生物活性检测，表明在致病机理方面占有重要地位。.本实验结果表明模型大鼠口腔溃疡部位组织中IL-6、TNF-α 水平显著升高，中、高剂量胖大海润喉丸可使口腔黏膜组织中IL-6、TNF-α 水平明显下降，具有统计学意义（P＜0.05）。从而表明胖大海润喉丸可以通过下调炎症因子，减轻口腔溃疡的程度、促进溃疡愈合。这与相关文献[12]报道是相一致的。

近年来有关FGF1、α-SMA 蛋白的异常表达在口腔溃疡发生、发展中的作用备受关注[13]。FGF1 是成纤维生长因子家族的成员之一，可诱导成纤维细胞的增殖生长[14-16]。α-SMA 是活化的成纤维细胞的蛋白标志物，它表达的增高提示着成纤维细胞的活化增多[17-18]。Ya Qing Tan 等[19]认为FGF1 促进组织愈合与其诱导纤维母细胞的增殖分化、促进血管再生以及诱导更多的营养素和氧运送至损伤区域有关。Lee 等[20]研究发现 Wnt/β-catenin 信号通路在组织愈合上发挥重要作用，当 β-catenin 的表达下降时，会出现 α-SMA 减少，组织愈合缓慢。 α-SMA 的表达还应该受Wnt/β-catenin 信号通路的调节。本研究结果显示，与模型相比较，中、高剂量组胖大海润喉丸FGF1、α-SMA 的蛋白表达含量均明显增高（P＜0.05）。表明胖大海润喉丸可能通过上调FGF1、α-SMA 蛋白含量，促进溃疡愈合期成纤维细胞大量活化增殖，参与溃疡愈合。

综上所述，胖大海润喉丸通过降低炎性因子水平，上调FGF1、α-SMA 蛋白含量，从而促进了口腔溃疡溃病临床愈合，缩短病程，减少复发。显示了胖大海润喉丸独具的特色和优势，具有效果显著、作用确切等特点，有良好的推广应用价值。