TGF-β1 基因多态性与宁夏回、汉人群慢性牙周炎相关关系的研究

田雯，苏文，龚娟，眭佳丽，李睿敏，董文亮）

（宁夏医科大学总医院，宁夏 银川）

0 引言

牙周炎是常见的多发于牙周的慢性炎症性疾病，其病灶在牙周支持组织上的牙龈病和牙周炎两大类疾病。我们把造成牙周病的始动因子归结为牙菌斑，但在临床研究中发现因个体不同因此牙菌斑又具有一定的差异性，[1]根据目前遗传学现状Michalowicz等利用经典双生子法巧妙地揭示了遗传因素影响牙周炎病程的重要程度[2]。转化生长因子-β1(TGF-β1)可由机体内多种细胞产生，存在于所有组织中，但在不同组织中含量大有不同，尤其在骨组织中含量居高，在炎症反应、组织修复、免疫应答等方面发挥着极其重要的作用[3]，它的多种作用与牙周炎的发生发展有关。在临床研究中不难发现汉族比回族人群CP 的患病率及病变程度要明显要高出很多[4]。本研究旨在探对TGF-β1-509 和TGF-β1+869位点的基因多态性与宁夏地区回、汉族人群CP 有无相关性，和差异性。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

病例组：选取我院接受治疗的288 例经牙周炎患者作为研究对象，根据诊断标准[5]全部诊断确诊为CP 患者，所有患者均来自于宁夏地区，其中回族143 例（女60 例，男83 例）；汉族145 例（女61 例，男84 例）；健康对照组298 例为本地健康志愿者，回族150例（女71 例，男89 例）；汉族148 例（男79 例，女69 例）；两组年龄均在30-75 岁之间，且均知情同意并签署知情同意书。

纳入标准：①家庭三代内未与其他民族通婚的宁夏本地回族或汉族；②全口牙数目＞14 颗；对照组则符合健康牙周的标准、病例组确诊为CP 患者的；③无局部刺激因素和明显的错牙和畸形；④半年内未接受任何牙周治疗；⑤无吸烟史或戒烟超过5 年以上。

排除标准：①牙颌或其他类型牙周损害；②身体其他部位严重感染；③心脑血管病、血液病及糖尿病等全身系统性疾病；④恶性肿瘤。

1.2 实验方法

1.2.1 主要试剂和仪器

Tag DNA 聚合酶、蛋白酶K（北京天根生物）、血液基因组DNA 提取试剂盒； Trans DNA Marker I（北京全式金生物技术）； Gel Doc XR 全自动凝胶图像分析仪（BIO-RAD，美国）；Ecol81 Ⅰ内切酶、MspA1 Ⅰ内切酶；T100PCR 仪、 Powerb 基础型电泳仪、引物由北京三博远志生物工程技术有限公司合成（表1）；Allegra21R 低温高速离心机（Eppendorf，德国）、H·SWX-600BS电热恒温水浴箱（上海电子仪器）。

1.2.2 基因组DNA 提取

抽取参加试验的全部受试者外周静脉血5mL，进行EDTA 抗凝，之后置于恒温-20°C 的温度下保存备用。待血液处理完成之后进行血液基因组DNA 提取。

1.2.3 引物的设计与合成

运用primer 5.0 软件设计两个位点的引物。即在Genewindow网站里将TGF-β1 基因多态位点rs1800469 和rs1982073 的DNA序列调出。

1.2.4 PCR 扩增

TGF-β1 基因-509 和+869 位点目的基因的PCR 反应体系：25mM MgCl21.5μl，dNTP2.5μl (2mmol/L)，10×buffer2.5μl，上下游引物各1μl (10pmol/μl)，Taq DNA 聚合酶0.25μl，模板DNA1μl，加无菌去离子水至25μl，混匀后进入PCR 循环。扩增反应条件：95℃预变性5 分钟；以下循环35 次(具体条件见表1)：退火、延伸、变性；72℃总延伸5 分钟，4℃保存。

1.2.5 基因型分析

运用RFLP（限制性内切酶片段长度多态性）方法对受试者TGF-β1-509 和+869 位点基因多态性的基因型[6-7]进行检测。限制性酶切反应体系：RE 10×buffer 1.0μl，限制性内切酶1.0μl，PCR 产物5.0μl，无菌去离子水加至10μl，混匀后采取37℃水浴酶切过夜；用仪器精准取10μl 酶切产物，待取出后在经2% 琼脂糖凝胶电泳/溴化乙锭（EB）染色后，确保提取物无任何污染后置于紫外线凝胶分析系统下，记录结果并分析其基因型（表1）。

1.2.6 PCR 和酶切质量控制措施

①在全部受测样品中随机抽取10%的样本，将取出的样本运用盲法对其基因型进行重复检测，以保证试验中检测PCR 产物及酶切结果的可靠性。②每次做酶切和PCR 时，在取样检测之前设置3-5 个阳性结果作为对照。③评价引物的特异性：在UCSC 数据库中，将引物进行电子PCR 扩增，且与Genebank 中的数据进行对比。④随机选择10% 的标本进行PCR 扩增后直接测序，以验证酶切所得的基因型数据结果的准确性。⑤测定所有DNA 标本其基因型时均运用盲法完成；操作者对样本的分组情况和样本的临床资料一无所知。

1.3 统计分析

所选对照人群的基因分型数据符合Hardy-Weinberg 平衡，才能进行多态性位点的相关性分析。反之将不能进行分析研究。本研究用H-W 平衡检测法来进行各基因多态性位点的基因频率分布检测，经χ2检验确定差异无统计学意义。结论表明所选对照人群数据符合H-W 平衡检测。在对照组和病例组进行对比时，对比研究对象的一般性资料（性别和年龄）时采用χ2检验方法，在进行处理数据时采用SPSS 18.0 统计软件，以及两组中基因型与等位基因频率的分布，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 研究对象的基本情况

对回族和汉族的对照组和病例组的年龄及性别分别进行χ2检验，结果无统计学意义(P＞0.05)(见表2)。

2.2 基因型分型结果

样本基因组DNA 提取、设计引物进行扩增，其PCR 产物分别为418bp 和219bp 的片段，酶切也获得成功，PCR-RFLP 与测序结果基因分型结果一致，测试结果分别用4 张图解释说明，基因型测定的电泳结果分别见图1、图2；测序结果见图3、图4。

2.3 基因多态性分析结果

2.3.1 TGF-β1-509（rs1800469）位点

汉族和回族的健康对照组和病例组基因型和等位基因频率的分布情况分别见表3，表4。汉族中两组样本检测数据经统计学分析，对比结果均有显著性差异(χ2=17.896，P＜0.01；χ2=15.716，P＜0.01)。回族两组经统计学分析结果：两组等位基因频率的分布差异无显著性(χ2=0.661，P=0.416)；但基因型的分布差异有显著性(χ2=7.078，P=0.029)。汉族与回族两组病例组的基因型和等位基因频率的分布情况见表5，对比结果有显著性差异(χ2=6.894，P=0.032；χ2=4.313，P=0.038)。

2.3.2 TGF-β1+869（rs1982073）位点

汉族TGF-β1+869 基因型及等位基因频率的分布见表6，回族TGF-β1+869 基因型及等位基因频率的分布详见表7。图表6中的数据为：χ2=0.585，P=0.746；χ2=0.075，P=0.784，经统计学分析结果为汉族两组差异均无统计学意义；回族两组差异无统计学意义(χ2=0.659，P=0.719；χ2=0.538，P=0.463)。回族与汉族病例组TGF-β1+869 基因型及等位基因频率的分布见8，两组亦无显著性差异(χ23.234，P=0.199；χ2=2.752，P=0.097)。

表2 各组研究对象年龄和性别的比较

图1 TGF-β1–509（rs1800469）基因分型结果 图2 TGF-β1+869（rs1982073）位点基因分型结果

图3 TGF-β1–509（rs1800469）位点测序结果

图4 TGF-β1+869（rs1982073）位点测序结果

表3 汉族TGF-β1-509 基因型及等位基因的分布

表4 回族TGF-β1-509 位点基因型及等位基因的分布

表5 TGF-β1-509 基因型及等位基因在汉族和回族病例组中的分布

表6 汉族TGF-β1+869 基因型及等位基因频率的分布

表7 回族TGF-β1+869 基因型及等位基因频率的分布

表8 回族与汉族病例组TGF-β1+869 基因型及等位基因频率的分布

3 讨论

目前世界公认的主要的两大类口腔疾病之一的牙周病，患病率较高，在我国更是居于龋病之上，严重影响人体健康[8]。在对此病病因的研究中，研究者认识到牙周病是由自身免疫、遗传易感性及环境、微生物等因素相互作用的复杂病因。有研究表明，细胞因子具有多种作用，一系列的研究数据表明其不仅可以调节细胞的生长和分化，还可以始发和维持免疫炎症反应。转化生长因子β，在淋巴细胞、巨噬细胞、肥大细胞、中性多核白细和炎性牙周组织中均可产生，是由白细胞产生的重要抗炎信号转化而来的。

TGF-β1 与牙周炎整个病理过程关系密切：首先，可以促进牙周膜细胞的增殖和分化[9]，调节牙周膜组织再生的前体细胞；其次，抑制破骨细胞的形成和活化，促进成骨细胞的增殖及细胞外基质的合成，诱导牙槽骨再生；然后，在牙周炎的免疫应答中起双向调节作用[10]。

对87 例来自东南亚地区的高加索人的TGF-β1-509 位点基因多态性研究，国外学者De Souza AP 等人的调查研究结果显示中、重度CP 患者和健康人三者之间等位基因和基因型分布存在明显差异，提示T 等位基因可能是CP 的易感基因[11]。但Holla LI等学者对198 例捷克高加索人的TGF-β1 基因-988C/A、-800G/A、-509C/T、+869T/C、+915G/C 位点的多态性进行研究，其中CP患者90 例和健康对照者108 例，结果发现在两组中的对比结果差别不大，不具备统计学意义，研究还提示TGF-β1-509 位点基因多态性与CP 无相关性[12]。相比于国外学者对国外人员的研究结论，我国学者管泽民在对河南汉族人群做了同种研究之后得出结论TGF-β1-509 位点基因多态性与CP 具有相关关系[13]。

本研究显示，等位基因C 在回族人群病例组和对照组分布频率前者略高于后者，但差异无统计学意义（P=0.416）；但两组在基因型分布上有统计学差异（P=0.029）。汉族人群病例组和对照组在基因型分布上的差异有统计学意义（P＜0.01），等位基因C在CP 组中的分布频率高于对照组，因此提示差异有统计学意义（P＜0.01）。对两民族CP 组进行比较，两组等位基因频率和基因型的分布差异有统计学意义（P 值分别为0.032 和0.038）。说明宁夏地区回族、汉族人群牙周炎的易感性与TGF-β1 基因-509 位点多态性可能有相关关系，并且该位点多态性在宁夏地区回、汉两族CP 患者之间的差异有统计学意义。这与Holla LI 等学者对捷克高加索人的该位点基因多态性研究，得出的该位点基因型和等位基因频率分布与CP 患者无相关性的结果有差异，而与管泽民等对河南汉族人群研究，该位点基因多态性与CP 具有相关性的结果一致。目前我们针对这一研究结果不一致的原因归纳为几点：首先，不同的种族，种族间的生活习惯差异和生活坏境可能会导致结果不同，且可能差异显著。其次，在取样过程中，样本量不足，样本量大小差异都可以直接导致研究结果发生偏倚。因此为了确保研究结果数据的准且性，就要求所取样本属同地区生活，同种族，同大小且足够的样本量。

目前，临床上比较缺乏对牙周炎受TGF-β1 外显子区+869 位点的基因多态性影响的研究，国外学者Kobayashi T 等对117 例日本牙周炎患者进行细胞因子基因多态性研究，发现TGF-β1+869位点与牙周炎无相关性[14]。Atilla G 等对土耳其的134 例CP 患者的TGF-β1 外显子区的+915 位点基因多态性进行研究，发现此位点基因多态性与CP 具有相关性[15]。李新华等根据人群种族分类对亚洲人和高加索人群的分层分析，得出结论在亚洲人群中TGF-β1+869 位点是导致类风湿性关节炎的危险因素，在高加索等欧美人群并未发现此结果，导致以上两种结论的原因可能与种族人群的饮食习惯、生活方式及遗传因素有关[16]。

上述与TGF-β1+869 位点相关的疾病都属于自身免疫性疾病，如：类风湿性关节炎、其他慢性炎症性疾病，尚未见其与CP 的相关报道，针对CP 这种慢性炎症性疾病，本研究对中国宁夏地区的CP 患者和该位点多态性做了相关性研究。研究发现该位点存在3 种基因型CC、CT 和TT，两种等位基因（C 和T），两族人群的基因型和等位基因在CP 组和对照组间分布差异均无统计学意义（前者P 值分别为0.719 和P=0.746）；（后者P 值分别为0.463 和P=0.784）。该位点基因型和等位基因在回汉两族的CP 组中的分布差异均无统计学意义（P 值分别为0.199 和0.097）。因此得出结论：宁夏回、汉两族地区人群的CP 易感性与TGF-β1+869 位点基因多态性可能不相关。

综上所述，不同地域、不同种族的不同人群中各种基因的等位基因频率和基因型有差异性，并且牙周炎是不同种族或民族人群所接触的环境诱导因素以及所携带的易感基因等多因素、多基因相关性疾病，不仅对探讨研究该疾病的发生、发展机制有着极其重要的意义，而且还能从基因水平寻找有效的诊断方法和合理的治疗措施。我们需要在不同地区、不同的种族之间采取大量样本量，以便进一步探寻转化生长因子β1 基因多态性与之间的相关关系，并且进行一系列综合性的研究，以此来揭示TGF-βl 基因多态性对牙周炎易感性产生的影响。