嗜酸氧化亚铁硫杆菌耐重金属离子连续转接驯化试验研究

刘玉龙，李广悦，胡 南，李建东，丁德馨

(1.南华大学 铀矿冶生物技术国防重点学科实验室，湖南 衡阳 421001；2.中广核铀业发展有限公司，北京 100029)

嗜酸氧化亚铁硫杆菌(AcidthiobacillusFerrooxidans,A.f)已被广泛应用于微生物冶金、煤炭脱硫和废水处理[1-3]。低品位铀矿石的微生物浸出也取得了良好的效果[4]。微生物在处理土壤重金属污染过程中也表现出良好的淋滤效果，其首要条件是微生物能适应重金属的环境[5-6]。

低品位铀矿石的A.f浸出，是利用A.f的氧化作用从铀矿石中提取铀的方法。A.f的氧化作用分为直接氧化作用和间接氧化作用，其中，直接氧化是通过A.f将黄铁矿、砷黄铁矿等硫化矿物氧化，实现铀矿石中铀的浸出；而间接氧化则是通过A.f将Fe2+氧化生成Fe3+，随后Fe3+被用作氧化剂，实现矿石中铀的浸出。如果铀矿石中含有较高品位的重金属，随着浸出的进行，浸出液中的重金属离子会富集得越来越多，吸收尾液中重金属离子的浓度也随之升高。吴学玲等[7]的研究表明，在培养液中添加150 mmol/L Cu2+或200 mmol/L Zn2+时，A.f的生长速率受到明显抑制，其Fe2+氧化速率出现显著差异。通常，环境中高浓度的重金属离子主要通过改变细菌细胞的渗透压，对细菌生长产生抑制甚至危害作用。在异常的生长环境中，细菌可通过调整自身的生理反应以适应渗透压的变化，从而表现出对重金属离子的耐受性。但是，细菌对重金属离子的耐受性受重金属离子种类及浓度的影响较大。因此，为增强A.f在实际矿石浸出液环境中的适应性，需要提高A.f对高浓度重金属离的耐受性及其氧化活性。

根据某含Cu、Mn、Cr和Pb铀矿石的A.f浸出需要，以A.f为试验菌株，采用连续转接驯化法提高A.f对Cu2+、Mn2+、Cr3+和Pb2+的耐受性；并结合其在驯化培养基中的适应时长，确定该菌株对4种重金属离子的耐受限值，为这类铀矿石的A.f浸出的实际应用提供理论依据。

1 试验材料与方法

1.1 试验仪器与设备

GSP-9080MBE隔水式恒温培养箱，SPH-200D小容量全温度恒温培养振荡器，SHA-B双功能水浴恒温振荡器，AL-104电子天平，BCD-195KAN冰箱，ALP高压灭菌器，SH23-2恒温磁力搅拌器，S20K Seven Easy数字pH仪。

1.2 试验试剂

本试验所需的化学药剂有(NH4)2SO4、KCl、K2HPO4、MgSO4·7H2O、Ca(NO3)2、H2SO4、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、3CdSO4·8H2O、Cr2(SO4)3·6H2O、Pb(NO3)2，均为分析纯。

1.3 菌种

采用的A.f由本实验室从中国某铀矿山酸性矿坑水中分离纯化得到，并保存在低温冰箱中。

1.4 培养基

9K培养基组分：(NH4)2SO4，3 g；K2HPO4，0.5 g；KCl，0.1 g；MgSO4·7H2O，0.5 g；Ca(NO3)2，0.01 g；FeSO4·7H2O，23 g；蒸馏水，1 000 mL。9K培养基pH=2.0，121 ℃灭菌15 min。

在9K培养基中，加入Cu2+、Mn2+、Cr3+和Pb2+重金属离子，配制成不同浓度的驯化培养基。

1.5 试验方法

1.5.1 配制培养基

按照9K培养基的配方称取化学试剂。先将除FeSO4·7H2O外的所有化学试剂倒入烧杯，用磁力搅拌器搅拌，将pH调节至2.5；再继续搅拌至所有化学试剂溶解后，加入FeSO4·7H2O，调节pH，使其稳定在2.0。

1.5.2A.f活化

将500 mL的三角烧瓶灭菌后，向其中倒入300 mL 9K培养基，加入50 mL菌液。测量溶液初始电位，用牛皮纸包好瓶口，放入SPH-200D小容量全温度恒温培养振荡器中培养，当溶液的电位达到-500 mV时，取出备用。

1.5.3A.f氧化活性的表征

A.f通过把培养基中的Fe2+氧化为Fe3+获得生长需要的能量。如果培养基中的电位持续升高，则表明A.f生长活性较高；当培养基中的氧化还原电位达到-500～-550 mV时，培养基中Fe2+的氧化比例达100%，表明A.f处于生长旺盛期[13]。此外，A.f在驯化培养过程中的适应时长与其氧化活性存在一定的相关性。A.f的氧化活性通过综合培养基的氧化还原电位和A.f的适应时长进行表征。

1.5.4 耐重金属离子驯化试验

将150 mL的三角烧瓶灭菌后，倒入80 mL的9K培养基，并接种20 mL的活化菌液。接种完成后，在培养基与菌液的混合体系中加入不同质量浓度的重金属离子。混合均匀后，测量初始溶液的电位和pH，并用牛皮纸包好瓶口，放入转速为180 r/min、温度为30 ℃的SHA-B双功能水浴恒温振荡器中培养，定期测量溶液的电位和pH。培养时间在2 d内时，每3 h测量一次；培养时间超过2 d时，每24 h测量一次。当溶液的电位超过-550 mV并趋于稳定时，表明该菌株能适应极端环境，对重金属离子产生了耐受性。取该菌液作为下一步耐重金属离子驯化试验的出发菌，按50%的接种量将驯化菌转接到具有更高重金属离子浓度的驯化培养基中。如此反复，直至该驯化菌的适应时长发生突变，此时的重金属离子浓度即为本研究中A.f的耐受限值。每组试验设3个平行样。

2 试验结果与讨论

2.1 A.f耐Cu2+驯化试验

A.f耐Cu2+驯化的试验结果见表1。

表1 A.f耐Cu2+驯化试验结果

从表1可看出，与对照样相比，接种于Cu2+质量浓度分别为2.0、4.0和6.0 g/L的驯化培养基中的A.f，其生长活性明显降低，完全氧化驯化培养基中Fe2+的时间由0.5 d延长至4～5 d。适应时长的延长表明这3种质量浓度的Cu2+对A.f有较强的毒害作用，抑制了A.f的生长繁殖，致使A.f需要经过一定时间的调整或改变代谢途径来适应新的环境[14]。

将Cu2+质量浓度为6.0 g/L的驯化培养基中的A.f进一步转接到Cu2+质量浓度相同的驯化培养基中，A.f氧化Fe2+的能力和效率明显提升，完全氧化Fe2+的时间由5 d缩短至2 d，表明连续转接驯化培养较大程度提高了A.f的驯化速度和效果。将上一级驯化后的A.f连续转接至Cu2+质量浓度分别为12.0、18.0和26.0 g/L的驯化培养基中，A.f完全氧化驯化培养基中Fe2+的时间分别为2、3和4 d，表明经过驯化的A.f在逐步提高Cu2+质量浓度时，其氧化活性逐渐降低，二者具有较强的相关性。

当Cu2+质量浓度达到30.0 g/L时，A.f的生长能力及对Fe2+的氧化能力受到强烈的抑制，第9天才能把驯化培养基中的Fe2+完全氧化。这与李洪枚[15]的研究结果一致，即Cu2+质量浓度在20.0～30.0 g/L的范围内，通过驯化能提高A.f的生长活性。当驯化培养基中Cu2+的质量浓度达到34.0 g/L时，A.f在驯化培养基中的适应时长发生突变，完全氧化驯化培养基中Fe2+的时间为23 d，表明此浓度下A.f的生长能力和氧化活性受到了较强的抑制和危害，即达到A.f生长可耐受的Cu2+浓度限值。

2.2 A.f耐Mn2+驯化试验

A.f耐Mn2+驯化的试验结果见表2。

表2 A.f耐Mn2+驯化试验结果

从表2可看出，与对照样相比，当A.f接种在Mn2+质量浓度分别为1.8、3.6和5.4 g/L的驯化培养基中时，完全氧化Fe2+的时间由0.5 d延长至4～5 d。Mn2+对A.f有较大的毒害作用，对其生长有较强的抑制作用，使其氧化活性维持在较低水平。因此，A.f在Mn2+存在的环境中需要一个较长的适应过程。

将Mn2+质量浓度为5.4 g/L的驯化培养基中的A.f进一步转接到Mn2+质量浓度相同的驯化培养基中，A.f完全氧化Fe2+的时间由5 d缩短至3 d，表明连续转接驯化可以明显提高A.f对Mn2+的耐受性。将驯化培养基中Mn2+的质量浓度逐步提高至10.8、16.2、21.6、28.8和34.2 g/L，A.f完全氧化驯化培养基中Fe2+的时间由1 d逐步延长至6 d。滕青等[16]研究表明，Mn2+质量浓度越大，A.f对环境的适应性越弱，迟缓期越长，A.f的比生长速率越小，进入对数期的时间越久。因此，随着Mn2+质量浓度升高，A.f适应时长延长的主要原因可能是A.f的生长活性受到抑制。

当驯化培养基中的Mn2+质量浓度达到41.4 g/L时，A.f完全氧化驯化培养基中Fe2+的时间为8 d。主要原因可能是高质量浓度的Mn2+对A.f产生明显的生理毒害作用，部分A.f因不能适应环境而死亡，导致A.f的数量减少，从而影响其对Fe2+的氧化速率。当驯化培养基中Mn2+质量浓度达到45.0 g/L，A.f的适应时长发生突变，完全氧化Fe2+所需时间为16 d，表明A.f代谢完全受到抑制，生长活性减弱，此时的质量浓度即为A.f生长可耐受的Mn2+浓度限值。

2.3 A.f耐Cr3+驯化试验

A.f耐Cr3+驯化的试验结果见表3。

表3 A.f耐Cr3+驯化试验结果

从表3可看出，Cr3+对A.f的毒害及阻生作用极其强烈。有关文献[17]报道，在Cr3+浓度较低时，可抑制A.f生长。当驯化培养基中Cr3+质量浓度仅为0.3 g/L时，A.f完全氧化Fe2+的时间为4 d，比对照样中A.f完全氧化Fe2+的时间延长了3.5 d。Cr3+质量浓度为0.6和0.9 g/L的驯化培养基中，A.f完全氧化Fe2+也需要6 d的时间，表明即使较低质量浓度的Cr3+也能明显抑制A.f的生长和氧化活性。

将在Cr3+质量浓度为0.9 g/L的驯化培养基中驯化过的A.f逐级连续转接至1.2和1.5 g/L的培养基中，A.f完全氧化Fe2+的时间均为4 d，比在Cr3+质量浓度为0.9 g/L的驯化培养基中的驯化时间缩短了2 d。结果表明连续转接驯化有效提高了A.f对Cr3+的耐受性，在较短时间内适应了新环境，氧化活性得到了提高。

将驯化培养基中的Cr3+质量浓度提高至1.8 g/L后，连续转接驯化后A.f完全氧化Fe2+的时间成倍增长，达到9 d，表明该质量浓度对A.f产生了很强的抑制作用，导致A.f氧化活性明显降低。当驯化培养基中Cr3+质量浓度提高至2.1 g/L时，A.f的生理活动受到较强的毒害，氧化活性明显降低，即达到A.f生长可耐受的Cr3+浓度限值。

2.4 A.f耐Pb2+驯化试验

A.f耐Pb2+驯化的试验结果见表4。

从表4可看出，将A.f接种到Pb2+质量浓度分别为1.0、1.5和2.0 g/L的驯化培养基中，其完全氧化Fe2+的时间由0.5 d延长至5 d。该现象表明，Pb2+对A.f的生长活性影响较大。当驯化培养基中Pb2+质量浓度逐渐增大时，A.f的活性明显降低，其生长受到抑制。晏铭等[18]的研究同样表明，A.f对Pb2+有一定的耐受性，通过驯化能筛选出耐受性强、生长活性高的性能优良的菌种。

将Pb2+质量浓度为2.0 g/L的驯化培养基中的A.f接种至Pb2+质量浓度为2.5 g/L的驯化培养基中，A.f完全氧化Fe2+的时间由5 d缩短至3 d。结果表明A.f在连续转接驯化下，很快适应了环境，增强了其对Pb2+的耐受性。将上一级驯化的菌液再次转接到Pb2+质量浓度为3.0 g/L的驯化培养基中，A.f完全氧化Fe2+的时间由3 d延长至8 d，表明3.0 g/L的Pb2+对A.f产生了明显的抑制作用。

当驯化培养基中Pb2+质量浓度达到3.5 g/L时，A.f需要相当长一段时间(17 d)来适应这一浓度，A.f生长基本处于停滞状态，细菌的氧化活性受到较强的抑制作用，此时的质量浓度即为A.f生长可耐受的Pb2+浓度限值。

3 结论

1)Cu2+、Mn2+、Cr3+和Pb2+的质量浓度越高，对A.f的生理毒害作用及生长抑制作用越明显。4种重金属离子对A.f的生理毒害作用的强弱排序为Cr3+>Pb2+>Cu2+>Mn2+。

2)接种比例为50%的连续转接驯化是一种可有效提高A.f对重金属离子的耐受性和A.f的氧化活性的驯化方式。经连续转接驯化后，A.f对重金属离子的耐受能力明显提高，生长停滞期缩短，氧化活性显著提高。

3)在接种比例为50%的连续转接驯化条件下，A.f对Cu2+、Mn2+、Cr3+和Pb2+的耐受限值分别为34.0、45.0、2.1和3.5 g/L。当重金属离子的质量浓度在耐受限值内时，连续转接驯化可以快速提高A.f对重金属离子的适应性及A.f的氧化活性；当重金属离子质量浓度高于耐受限值时，A.f的生长基本处于停滞状态，氧化活性较低。在后续的研究中可进行高浓度下的等浓度连续转接驯化培养，以最大限度地提高A.f对重金属离子的耐受性。