糖尿病肾脏病与足细胞自噬

冯祥田，于为民

(1.山西医科大学，太原 030000； 2.山西白求恩医院肾内科，太原 030000)

糖尿病是危害人类健康的疾病之一，患病群体庞大。糖尿病及其并发症给患者带来巨大痛苦，并严重影响生活质量。据《国际糖尿病联盟全球糖尿病地图(第9版)》最新数据显示，全球20～79岁人群中约有4.6亿(占比9.3%)患糖尿病，2019年因糖尿病及其并发症死亡的人数约为420万[1]。糖尿病肾脏病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病最严重的微血管并发症之一，也是终末期肾病的主要原因。DKD的一个重要临床特征是蛋白尿。糖尿病蛋白尿患者肾小球滤过屏障结构发生改变，包括肾小球内皮细胞损伤、足细胞丢失、肾小球基膜增厚和系膜扩张。除基底膜功能障碍外，晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)的积累、氧化应激以及内质网应激的激活也是导致肾功能下降的原因[2-5]。自噬尤其是足细胞自噬与DKD关系密切，足细胞自噬异常可能在DKD的发生发展过程中发挥重要作用。现就DKD与足细胞自噬的关系及其涉及的具体机制进行综述。

1 DKD与足细胞损伤自噬

“自噬”一词可追溯至古希腊，意为“自我吞噬”。现代生物学中“自噬”代表一种在各种细胞中普遍存在的细胞过程，主要指在某些生理或应激条件下，细胞内错误折叠的蛋白质或其他受损的细胞器以囊泡的形式运送到溶酶体，通过溶酶体降解和循环，以维持细胞内的稳态。根据发生机制、功能的不同，自噬可分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬，通常所说的“自噬”为巨自噬。根据降解底物的不同，自噬也可分为选择性自噬和非选择性自噬。选择性自噬涉及一些受损细胞器的降解、脂噬或异种吞噬，而缺乏营养诱导的自噬被认为是非选择性自噬[6]。自噬主要是由自噬相关基因(autophagy associated gene,ATG)产物协同作用导致的复杂过程，目前已经发现的自噬相关蛋白(Atg)有近40种，根据参与的过程，可分为4类：①unc-51样自噬激活激酶1(unc-51 like autophagy activating kinase 1,ULK1)-Atg13-FIP200(FAK-family interacting protein of 200 kDa)复合体，ULK1、Atg13和FIP200形成的复合体可以定位自噬的隔离膜，并调节自噬体生物合成；②Vps34复合体由hVps34、hVps15、Beclin-1以及Atg14组成，主要参与形成自噬体；③Atg5-Atg12-Atg16和Atg8/自噬相关基因微管相关蛋白1轻链3两个泛素连接系统。Atg在酵母菌和哺乳动物中高度保守，并在自噬体的形成过程中参与膜转运过程[7]。

足细胞自噬对肾脏功能的完整性至关重要[8]。足细胞是一种存在于肾小球基膜表面的高度分化的细胞，其在肾小球基膜上形成许多突起，被称之为“足突”，足突交叉相接形成裂孔结构，裂孔上覆有一层4～6 nm厚的裂孔膜[9]。足细胞和足突间的裂孔膜是肾小球滤过屏障中最重要的成分，足细胞损伤是急性肾损伤的典型特征，可导致蛋白尿和营养丢失[8,10-11]。对小鼠的研究发现，正常肾组织中足细胞表现出较高水平的自噬，形成丰富的自噬小体[12]。Vps34复合体缺失的9周龄小鼠表现出早期蛋白尿、进行性肾小球硬化和肾衰竭等症状[12]。足细胞ATG5基因缺失可导致衰老小鼠的肾小球病变，而氧化和泛素化相关蛋白的积累和足细胞内质网应激最终可导致足细胞丢失、蛋白尿增加以及肾小球硬化等[11,13]。

Lenoir等[14]研究发现，高糖环境激活了足细胞自噬，保护足细胞免受高血糖相关的凋亡。在糖尿病小鼠中，ATG5基因敲除使自噬激活缺乏，进而导致更严重的蛋白尿和肾功能受损[5,15]。在DKD中，肾脏自噬受损也会导致足细胞丢失和大量蛋白尿[16]。糖尿病小鼠雷帕霉素靶蛋白复合体1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)活性降低可刺激自噬，减少肾小球硬化、蛋白尿和足细胞丢失，从而减缓DKD进展[3]。但有研究表明，高糖通过激活胱天蛋白酶3，导致足细胞凋亡[17]。在高糖刺激下，人足细胞自噬相关基因微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ和Beclin-1显著减少，自噬活性降低[18]。目前这些争议尚未解决，还需要进一步研究。以上研究均表明，足细胞自噬在DKD中有重要作用，而自噬也可能成为DKD治疗的重要靶点。

2 营养传感途径与DKD足细胞损伤自噬

影响自噬的因素较多，参与自噬调控的通路也较多，如转化生长因子-β1通路、Rho/Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶通路、Wnt/β联蛋白通路、Notch通路等，其中营养传感途径在自噬调控中尤为重要。目前已知的营养传感途径主要包括哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)、去乙酰化酶(sirtuin，SIRT)3等。在过度营养的条件下，葡萄糖、氨基酸和胰岛素等生长因子水平的升高会激活mTOR[19-20]；在营养/能量耗竭的条件下，细胞内AMP和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotid，NAD+)水平的升高会激活AMPK和SIRT信号途径[21-22]。这些营养传感途径的失调可能会损害自噬活性，导致DKD患者肾脏损伤加重[23-24]。

2.1mTOR途径 mTOR是磷脂酰肌醇-3-激酶家族的成员，是细胞代谢的关键参与者之一，在维持营养有效性、能量以及机体平衡中有重要作用[25]。mTOR被认为是DKD中最重要的自噬调节因子之一。mTOR可与相关蛋白结合形成两种不同的复合体，即mTORC1和2。mTORC1对雷帕霉素敏感，由mTOR、G蛋白β亚基样蛋白、mTOR调节相关蛋白、40 kD大小的富含脯氨酸蛋白激酶B底物蛋白和含DEP结构域的mTOR相互作用蛋白组成[26]。对雷帕霉素不敏感的mTORC2由mTOR、雷帕霉素不敏感的mTOR伴侣、G蛋白β亚基样蛋白、在雷帕霉素不敏感的mTOR伴侣中观察到的蛋白质以及应激激活的蛋白激酶相互作用蛋白1组成[26]。

mTORC1主要通过小GTPase接受营养输入，参与功能的小GTPase主要有Ras相关的GTP结合蛋白和脑中富集的Ras同源蛋白(Ras homolog enriched in brain，RHEB)。氨基酸和生长因子水平的升高分别通过Ras相关的GTP结合蛋白和RHEB激活mTORC1，mTORC1的激活促进两个下游靶标分子的磷酸化，刺激核糖体生物发生和蛋白质合成。结节性硬化复合物(tuberous sclerosis complex,TSC)1/2是mTOR基因上游抑制因子，抑制RHEB负向调节mTORC1的活性[26]。过度激活的mTOR是引起肾小球损伤的重要因素之一，如敲除TSC1可发现mTORC1过度活化、足细胞和肾小球受损[27]。具体而言，mTOR1通过磷酸化ULK1而抑制其活性，负调节自噬[28]。然而在营养缺乏或其他应激信号的细胞中，mTORC1的表达被抑制，AMPK途径激活ULK1，促进自噬发生[29]。雷帕霉素可抑制mTORC1信号通路，保护肾脏。低剂量的雷帕霉素可通过调节糖尿病小鼠的自噬而改善足细胞损伤，维持足细胞数量的稳定[29]。

mTORC1对于维持足细胞的功能至关重要，并参与DKD的发生发展。目前对于mTORC2在足细胞自噬中的调节作用仍不明确，需要进行深入研究。

2.2AMPK途径 AMPK是一种进化上保守的异源三聚体蛋白复合物，由α、β、γ三个亚单位组成，在细胞能量稳态和代谢中起关键作用。AMPK的激活是由几种上游激酶介导的，在能量应激条件下，肝激酶B1是磷酸化AMPK的主要激酶[30]。与mTORC1相比，AMPK是对营养/能量消耗响应的自噬的正性调节剂。一方面，AMPK可以直接磷酸化ULK1以促进自噬(与mTORC1磷酸化ULK1的位点不同)[31]；另一方面，AMPK可通过磷酸化TSC1/2和mTOR调节相关蛋白抑制mTORC1的活性，进而发挥自噬诱导作用[32]。除了AMPK和mTORC1对ULK1的相反调节外，ULK1还可通过负反馈抑制两个上游调节子。这三种相互联系的蛋白质的复杂串扰和反馈可能会进一步调节代谢应激条件下的自噬反应。

在1型和2型糖尿病模型的肾脏中，AMPK的活性被抑制，多种AMPK激活剂可以减轻糖尿病性肾损伤。AMPK抑制剂白藜芦醇可促进AMPK的磷酸化，有效减轻糖尿病小鼠细胞外基质扩张、炎症和蛋白尿[33]。二甲双胍是一种AMPK刺激剂和抗糖尿病药，其可保护足细胞免受糖尿病的伤害[33]。一项研究表明，小檗碱对2型糖尿病小鼠的肾保护作用是AMPK依赖性的[34]。在培养的小鼠足细胞中，小檗碱通过重新激活AMPK和自噬抑制高糖诱导的细胞凋亡[35]。

除自噬调节外，AMPK还介导肾脏的一系列代谢过程，如脂质代谢、糖原合成以及肾小管对Na+和葡萄糖的重吸收。糖尿病条件下肾脏AMPK活性的降低可能损害以上代谢过程以及自噬抑制，导致DKD的肾小管和肾小球病变[23]。

2.3SIRT1途径 SIRT是NAD+依赖的Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶(NAD+-dependent class Ⅲ histone deacetylases，HDAC)，在细胞应对氧化还原和代谢压力过程中发挥重要作用[36]。目前已鉴定出7个哺乳动物的SIRT(SIRT1～SIRT7)，其中SIRT1研究得最多。SIRT1通过监测NAD+水平发挥细胞内营养感受器的作用，进而调节代谢和氧化还原状态。在营养缺乏和氧化应激条件下，细胞内NAD+水平升高会上调SIRT1，而缺氧时NAD+可用性降低，可能会使SIRT1失活[36]。SIRT1是自噬的正调控因子，一旦激活可通过去乙酰化必需的自噬蛋白(如ATG5、ATG7和自噬相关基因微管相关蛋白1轻链3)促进自噬[37]。

SIRT1主要在肾内髓和肾间质表达，可能具有保护肾脏免受氧化应激的作用。与AMPK相似，在人和动物的DKD模型中，SIRT1的表达和活性均有降低的趋势，SIRT1的激活可以保护肾脏免受糖尿病的损伤[38]。糖尿病小鼠肾小球SIRT1表达减少可导致AGEs积聚和转录因子叉头框蛋白O4乙酰化，白藜芦醇可保护足细胞免受AGEs诱导的凋亡[39]。发生蛋白尿前，在糖尿病小鼠的足细胞和近端小管中检测到SIRT1的抑制；而近端小管特异表达SIRT1的小鼠对糖尿病相关的足细胞损伤进展和随后的蛋白尿具有抵抗力[39]。研究发现，白藜芦醇对2型糖尿病大鼠和缺氧处理的人来源肾近端小管上皮细胞的保护作用依赖于其对SIRT1的重新激活和随后的自噬恢复[40]。以上研究表明，SIRT1对肾脏有保护作用，SIRT1活性降低通过抑制自噬而导致与DKD相关的肾脏损伤。

除SIRT外，HDAC家族其他分子也与肾脏损伤有关，这些分子可能成为潜在的治疗靶点。目前在哺乳动物细胞中鉴定的HDAC基因有18个，根据序列同一性和结构域的不同可分为Ⅰ～Ⅳ类，其中Ⅲ类HDAC(SIRT)是NAD+依赖的，其他(Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ类)HDAC主要依赖于Zn2+。与SIRT对肾脏的保护作用不同，Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ类HDAC的表观遗传学修饰在DKD的发生发展中有重要作用。这表明不同的HDAC在DKD中可能有不同的功能，除SIRT的保护作用外，其他HDAC可能也参与了肾脏的损伤过程。为确定单个HDAC的作用，Wang等[41]使用不同的DKD模型分析了HDAC的表达模式，在所有检测的HDAC中，HDAC2、HDAC4和HDAC5在链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠、2型糖尿病小鼠的肾脏以及糖尿病患者的肾组织中表达上调。不同类型的HDAC存在于不同类型的肾细胞中，HDAC2在肾近端小管上皮细胞中，HDAC4在足细胞中，HDAC5在系膜细胞中。高糖、AGEs和转化生长因子-β处理的足细胞，HDAC4的表达也增加，提示HDAC4可能在糖尿病肾病足细胞的功能调节中起中心作用[41]。事实上，足细胞中选择性上调HDAC4通过去乙酰化信号转导及转录激活因子抑制自噬，并导致足细胞损伤。抑制HDAC4可防止足细胞自噬缺陷，从而保护足细胞免受DKD诱导的肾小球病变[41]。

总之，以上研究进一步证实了缺陷自噬与DKD进展之间的联系，考虑到糖尿病肾脏中Ⅲ类SIRT和Ⅱ类HDAC4对自噬的相反作用，靶向HDAC治疗DKD需要确定HDAC亚型特异性。

3 细胞内应激与DKD足细胞损伤自噬

除了营养传感途径外，自噬还受几种细胞内应激信号的调控，如AGEs积累、氧化应激以及内质网应激。糖尿病条件下，mTORC1的过度激活或AMPK和SIRT1的失活抑制了肾脏中的自噬。自噬是一种代偿反应，是由这些应激信号诱导的，目的是维持细胞的完整性。当这种适应性代偿反应无效时，自噬所形成的受损细胞器(如线粒体和内质网)可能会在细胞中积累，并加剧DKD。

3.1AGEs AGEs是高糖状态下的蛋白质、脂质、氨基酸、核酸等生物大分子物质的游离氨基与还原的醛基或酮基发生非酶糖基化反应形成的一类复杂物质。研究发现，AGEs对肾脏的损伤方式包括直接毒性作用和间接毒性作用两种。Kanwar等[42]研究发现，高血糖状态所引起的肾脏损伤会造成细胞内代谢状态的改变，AGEs在肾脏组织中逐渐累积，直接造成DKD的发生。AGEs的间接毒性作用是指AGEs与其受体结合后，进而通过多种跨膜信号转导机制，造成细胞功能障碍；AGEs与其受体结合后还可诱导细胞氧化应激，产生活性氧类(reactive oxygen species,ROS)、活化蛋白酶C等，导致氧化损伤，促进DKD的发生发展。Peng等[43]发现，糖尿病的血管并发症可被AGEs的自噬清除作用缓解，而小鼠肝细胞生长因子重组体可加强内吞作用和AGEs的自噬清除作用，进而改善肾功能。

因此，靶向清除AGEs，降低AGEs水平可能对肾脏有保护作用，减缓DKD的发生发展。

3.2氧化应激 ROS通常由线粒体呼吸和各种代谢途径中的氧化还原反应生成。过量的ROS通常是造成细胞损伤的原因，同时细胞内也有一组完备的抗氧化酶，ROS生成与抗氧化剂防御之间的不平衡导致了氧化应激[44]。糖尿病情况下，高血糖会增强肾脏中ROS的产生。高糖介导的细胞内代谢改变，包括葡萄糖的自氧化、晚期糖基化、蛋白激酶C活化和多元醇途径流量的增加，这些是糖尿病肾中ROS的来源。糖尿病条件下，高水平的非酯化脂肪酸也可刺激ROS的产生[45]。

有研究表明，急性暴露于高葡萄糖可通过ROS激活自噬[15]。在暴露于高糖的永生化小鼠足细胞中，自噬在ROS产生的24 h内被诱导，而这一自噬可被抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸抑制[15]。足细胞暴露于血管紧张素Ⅱ中也可增强ROS的产生并诱导自噬，抗氧化剂治疗可抑制自噬。以上研究表明，在早期糖尿病中，足细胞主动响应ROS发生自噬。氧化应激可以诱导自噬以移除受损的线粒体，进而降低ROS水平，保护肾脏功能。

3.3内质网应激 内质网是真核细胞中蛋白质合成、折叠和成熟所必需的细胞器。内质网稳态破坏导致未折叠和错误折叠的蛋白质累积，导致内质网应激并触发未折叠的蛋白质反应。内质网应激可诱导自噬，并参与糖尿病及DKD的发生发展[46]。在DKD中，高血糖和高水平的非酯化脂肪酸诱导足细胞内质网应激、凋亡以及随后的蛋白尿。有研究发现，从肾小球滤出的蛋白尿进一步加重了近端小管的内质网应激反应，导致肾小管间质损伤[47]。暴露于高糖和白蛋白的肾小管细胞，内质网应激也被诱导，并伴随肾小管细胞凋亡。此外，老年糖尿病小鼠模型也存在内质网应激，激活CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白，加重糖尿病肾损伤；而CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白缺陷小鼠可降低DKD的发生率，进一步表明糖尿病诱导的内质网应激在肾脏损伤的发展中起重要作用[48]。

自噬在维持内质网结构和功能完整性方面也发挥着重要作用。糖尿病的自噬缺陷可导致内质网应激的延长和肾脏损伤，激活自噬、促进内质网降解的治疗策略可以保护肾脏免受细胞毒性内质网应激。化学伴侣可以减轻内质网应激，抑制DKD损伤。研究发现，化学伴侣牛磺酸熊去氧胆酸能减少内质网应激、抑制AGEs诱导的凋亡[49]。采用化学伴侣牛磺酸熊去氧胆酸治疗的糖尿病小鼠，自噬功能得以恢复，并伴随足细胞损伤和蛋白尿的减少，初步证实了化学伴侣牛磺酸熊去氧胆酸对糖尿病小鼠肾脏的保护作用[49]。化学伴侣4-苯丁酸也表现出类似的作用[50]。以上研究结果进一步证实了内质网应激参与DKD的发病机制。化学伴侣通过重新激活自噬、抑制内质网应激，达到保护肾脏功能的目的。

4 小 结

DKD是糖尿病严重的微血管并发症之一，研究DKD发生发展的机制对于DKD的防治具有重要意义。在高糖环境下，足细胞自噬可以保护足细胞免受高糖诱导的凋亡，从而保护肾脏功能，自噬的缺失会严重损伤肾脏的功能。足细胞自噬与DKD的发生发展密切相关，营养传感途径与足细胞自噬密切相关，mTOR途径抑制足细胞自噬，参与DKD的发生发展；而AMPK途径和Sirt1途径促进足细胞自噬，激活AMPK途径或Sirt1途径可能有助于DKD的治疗。

细胞内应激也是影响DKD足细胞自噬的重要因素，AGEs的直接和间接毒性作用损伤肾脏功能，靶向清除或利用自噬清除AGEs有助于DKD的治疗；糖尿病条件下ROS激活足细胞自噬，而自噬诱导受损线粒体的移除，降低ROS水平，进而保护肾脏功能。内质网应激可以诱导自噬，参与DKD过程，靶向内质网应激的化学伴侣可以抑制糖尿病肾脏损伤，保护肾脏功能，有望成为治疗DKD的药物。目前，关于DKD足细胞损伤自噬的研究较多，但不同途径的研究还有待于进一步深入，针对这些途径的药物也有待于开发，以期为DKD的治疗提供新的方案。