微RNA在多囊卵巢综合征发病机制中的研究进展

李忆昆，沈山梅

(东南大学医学院南京鼓楼医院内分泌科，南京 210008)

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育龄期女性常见的生殖内分泌和代谢疾病，其发病率高达5%～10%[1]。PCOS主要以稀发排卵(无排卵)、卵巢多囊样改变和雄激素过多为特征。许多患有PCOS的女性还患有胰岛素抵抗，高胰岛素血症可促进卵巢(和肾上腺)雄激素的产生，并通过降低性激素结合球蛋白水平来增加雄激素的生物利用度。PCOS的发病机制尚不明确，近年研究表明，遗传和环境因素与PCOS密切相关，PCOS是一种多基因病，目前的候选基因研究涉及胰岛素作用相关基因、高雄激素相关基因等[2]。微RNA(microRNA，miRNA)是一类长约22个核苷酸的非编码RNA，通过与靶基因的互补或非互补结合参与生物的合成、分化、增殖、凋亡及信号转导。近年来研究发现，部分miRNA表达在多种疾病中发生了改变，并且通过上述各种途径参与了疾病的病理生理过程，如癌症、代谢疾病和生殖异常等[3-5]。迄今为止，许多学者已经探索了PCOS的miRNA表达差异谱，发现部分miRNA与卵泡发育、雄激素异常和胰岛素敏感性直接或间接相关[6]，这使得miRNA有望作为PCOS新的诊断生物标志物及治疗的靶点。现就miRNA在PCOS发病机制中的研究进展予以综述。

1 miRNA概述

miRNA最早被发现于20世纪90年代初[7]，但直到21世纪初，科学家才开始意识到这些无处不在的小分子在真核基因表达调控中所起的广泛作用[8]。基因组通过RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ，转录为包含成熟序列的发夹结构的初级miRNA，由重组人核糖核酸酶3及其辅因子负责切除发夹，产生前体miRNA，通过输出蛋白5从细胞核转运至细胞质；另一种含有Dicer酶的蛋白质复合物进一步加工前体miRNA，产生含有成熟miRNA的双链复合物[9]。miRNA主要参与生物体内的转录后调控，它对靶基因mRNA的作用主要取决于与mRNA 3′非翻译区的碱基序列互补的程度，与之完全互补结合的miRNA能够切断靶基因的mRNA，而与之不完全互补结合的miRNA能够抑制靶基因的翻译[10]。研究显示，预计超过60%的人类基因是miRNA的靶标，并且许多miRNA能够靶向多种mRNA[11]。miRNA水平的微小偏差可能扰乱许多靶基因的调节，因此，控制miRNA生物发生对于维持正常细胞生物学至关重要。对miRNA功能的干扰可导致许多人类疾病的发生。研究显示，女性体内有多种miRNA参与卵巢激素代谢、颗粒细胞增殖和凋亡、卵泡发育与闭锁调控等，卵巢miRNA的表达异常或功能障碍会影响卵泡发育与闭锁以及激素的合成和代谢，导致PCOS等卵巢源性疾病的发生[12]。

2 miRNA参与PCOS的病理生理过程

2.1miRNA与卵巢激素 异常的卵巢类固醇激素合成与代谢参与PCOS的发生[13]。miRNA的表达可能对类固醇合成代谢涉及的特定基因的表达具有直接的调节作用[14-15]。因此，了解miRNA影响卵巢类固醇激素的机制对于类固醇相关疾病(如PCOS)具有重要意义。

雄激素对女性的生殖功能有重要意义，具有生物活性的睾酮为游离睾酮，其水平仅为总睾酮的1%～2%，血液循环中的睾酮主要与性激素结合球蛋白或白蛋白结合[16]。过量的雄激素是PCOS的病理生理学特征之一。Murri等[17]发现，部分miRNA的血清表达水平在PCOS患者中与男性对照组相似，而与正常女性对照组有差异；此外，这些miRNA(miR-193a-5p、miR-199a-3p和miR-597-5p)水平与血清睾酮和雌二醇水平具有相关性。Xue等[18]的鉴定结果显示，PCOS卵泡液中7种miRNA(miR-200a-3p、miR-10b-3p、miR-200b-3p、miR-29c-3p、miR-99a-3p、miR-125a-5p和miR-105-3p)与PCOS中的高雄激素血症相关。另有研究报道，miR-93和miR-21在PCOS卵巢颗粒细胞中表达增加，并且与游离睾酮和雄激素指数呈正相关；进一步分别用双氢睾酮和比卡鲁胺处理颗粒细胞后，双氢睾酮诱导miR-93和miR-21上调，而用比卡鲁胺预处理的颗粒细胞能阻断双氢睾酮对miR-93和miR-21表达的影响[19]。miR-93和miR-21可通过靶向受体基因Smad 7调节转化生长因子-β信号通路，从而减少雄激素的生物合成，促进卵泡发育[20-21]。

PCOS还与持续快速的促性腺激素释放激素脉冲、过量的促黄体生成素(luteinizing hormone，LH)和不足的促卵泡生成素(follicle-stimulating hormone，FSH)分泌有关，可导致过多的卵巢雄激素生成和排卵功能障碍[22]。卵泡膜细胞在LH刺激下将胆固醇合成为雄激素，卵巢颗粒细胞在FSH刺激下将睾酮和雄烯二酮转化为雌激素[23]。在双氢睾酮处理的PCOS大鼠中，miR-132的下调与LH水平相关[24]。此外，Sang等[25]发现，卵泡液中下调的miR-132和miR-320通过靶向高迁移率族蛋白A2和Ras相关蛋白5B基因，抑制雌二醇的合成，从而参与PCOS高雄激素血症的发生。雌雄激素的生物转化主要依赖于芳香化酶p450基因(cytochrome p450 genes，Cyp19a1)编码的芳香酶[26]。在PCOS模型鼠中，miR-27a-3p表达增加，其通过靶向环磷腺苷效应元件结合蛋白1(cAMP-response element binding protein 1，Creb1)激活下游基因Cyp19a1，导致雌二醇和雄激素失衡，而高水平的雄激素还可反向激活miR-27a-3p，进一步促进PCOS的雄激素代谢紊乱[27]。在以剂量依赖性上调miR-383水平后，通过抑制转录因子RBMS1(RNA binding motif single stranded interacting protein 1)基因，小鼠颗粒细胞Cyp19a1基因表达增加，释放更多的雌二醇[28]。另外，目前已在PCOS卵泡液中检测到上调的miR-383水平，其可能通过Cyp19a1介导PCOS异常升高的雌激素[29]。上述miRNA的差异表达可能解释异常的雄激素，并有助于鉴定以高雄激素为表型的PCOS。

2.2miRNA与胰岛素抵抗 患有PCOS的女性会增加糖代谢紊乱风险，据报道PCOS患者的胰岛素抵抗发生率超过70%[30]。葡萄糖主要通过胰岛素反应性葡萄糖转运体4(glucose transporter 4，GLUT4)穿过细胞膜进入细胞[31-32]。检测GLUT4在4组女性(PCOS合并胰岛素抵抗、单纯PCOS、对照合并胰岛素抵抗和单纯对照)脂肪细胞中的表达发现，miR-93、miR-133和miR-223在PCOS女性中过表达，miR-93主要通过抑制GLUT4，损害葡萄糖跨膜转运，从而参与PCOS胰岛素抵抗的发生[33]。既往有研究提示，miR-133和miR-223靶向GLUT4表达并调节葡萄糖代谢[34-37]。此外，与正常胰岛素敏感性的3T3-L1脂肪细胞相比，miR-320的表达水平在具有胰岛素抵抗的3T3-L1脂肪细胞中增加50倍，在加入抗miR-320寡核苷酸后，胰岛素敏感性得到恢复，GLUT4表达上调，胰岛素介导的葡萄糖摄取增加[38]。

多个信号通路相互作用共同调节细胞增殖及胰岛素代谢，胰岛素与磷酸化底物分子的受体结合后，底物磷酸化水平升高[39-40]。除了影响葡萄糖的转运外，部分miRNA还参与胰岛素信号通路中重要基因的表达。miR-9、miR-18b、miR-32、miR-34c和miR-135a在PCOS女性中过表达，且通过靶向胰岛素受体底物2、突触结合蛋白1和白细胞介素-8，影响碳水化合物代谢和胰岛β细胞的功能、细胞间信号转导及类固醇激素合成等[29]。而miR-145被发现能够抑制颗粒细胞的增殖，并靶向胰岛素受体底物1基因，调节磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号通路，改善PCOS的胰岛素抵抗[41]。此外，在使用来曲唑建立的PCOS模型鼠中检测到了miR-484、miR-375-3p、miR-324-5p、miR-223-3p、miR-201-5p、miR-34b-5p、miR-141-3p和miR-200a-3p的差异表达，这些miRNA参与胰岛素分泌和信号转导(如Wnt、腺苷酸活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B和Ras)[42-43]。miRNA通过参与葡萄糖转运与胰岛素信号通路影响PCOS女性胰岛素抵抗的发生，为疾病提供了新的治疗靶点。研究发现，合气散作为一种中药，可能通过介导miR-144-3p对胰岛素抵抗的PCOS治疗有益[44]。二甲双胍是治疗胰岛素抵抗的PCOS患者使用最广泛的药物，二甲双胍可降低肝葡萄糖产生，同时刺激胰岛素敏感组织中的葡萄糖摄取并改善脂质代谢，给予二甲双胍可能改变几种miRNA的表达模式。例如，miR-221和miR-222的表达水平在糖尿病患者中升高，而在二甲双胍治疗患者中的表达水平与非糖尿病患者相似[45]。此外，还有部分二甲双胍对各种癌症miRNA表达改变的研究[46-47]，但尚未有关于二甲双胍治疗PCOS后miRNA表达变化的研究。

2.3miRNA与卵泡发育 卵泡的发育是涉及多个细胞、多个阶段的复杂过程。卵丘细胞是围绕在卵母细胞外周并与之进行代谢联系的颗粒细胞群。卵丘细胞的主要功能是在排卵前将营养和新陈代谢转移到卵母细胞。因此，卵丘细胞的生物学变化影响卵母细胞的发育。在PCOS卵丘细胞中，Liu等[48]发现，miR-hsa-miR-513-3p、miR-508-3p、miR-513b和miR-144显著过表达，而miR-hsa-miR-455-3p和miR-615-3p低表达。Shi等[49]发现，miR-483-5p和miR-486-5p表达降低，且它们的靶基因与胰岛素抵抗、糖耐量异常及2型糖尿病密切相关。胰岛素样生长因子2的高表达提示卵母细胞更好的成熟，作为miR-483-5p的共表达基因，胰岛素样生长因子2基因在PCOS组的卵丘细胞中也低表达[50]。另外，降低人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因的水平可能促进卵泡的发育，miR-486-5p下调可诱导卵丘细胞中人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因过表达，从而阻碍卵泡发育[51]。另外，PCOS女性卵丘细胞中miR-323-3p的水平显著下调，miR-323-3p直接靶向胰岛素样生长因子1，调节类固醇生成和卵丘细胞活性，从而参与PCOS的发病[52]。

颗粒细胞凋亡增加、增殖率降低以及功能紊乱与PCOS的异常卵泡之间存在密切联系[53-54]。目前已有部分研究探索了miRNA如何通过影响颗粒细胞参与PCOS的异常卵泡发育。Xu等[55]发现，miR-483-5p可能参与Notch信号转导和胞外信号调节激酶通路诱导的颗粒细胞发育、分化和增殖的调节以及PCOS卵泡中异常激素微环境的负反馈环节。Fu等[56]发现，miR-16的表达在PCOS患者的卵巢皮质组织和血清中均下调，使得程序性细胞死亡蛋白4(programmed cell death protein 4，PDCD4)表达上调，颗粒细胞增殖率降低。此外，较高的PDCD4表达与PCOS中的肥胖、胰岛素抵抗、脂质代谢紊乱及颗粒细胞凋亡有关[57]。表明，PCOS患者下调的miR-16直接靶向PDCD4，增强颗粒细胞凋亡并阻断其增殖。其他研究发现，miR-145可靶向颗粒细胞中的胰岛素样生长因子1及激活素受体ⅠB，抑颗粒细胞增殖[41,58]。另外，还有几项研究发现，上调的miR-27a-3p在卵巢颗粒细胞中通过靶向抑制Smad5和Creb1基因，抑制颗粒细胞增殖，并促进细胞凋亡及雌雄激素转化，从而参与PCOS异常卵泡的发生[27,59]。Jiang等[60]发现，miR-324-3p转染的PCOS大鼠颗粒细胞的增殖受到显著抑制，细胞凋亡显著增多，沉默其靶标基因 Wnt2B(wingless integrated 2B)表达，可以逆转miR-324-3p对颗粒细胞增殖和凋亡的影响。

总之，卵巢miRNA的表达改变可能在卵丘细胞及颗粒细胞增殖和分化与凋亡的过程中起作用，从而参与PCOS异常卵泡发育的过程。

3 miRNA与不孕症

Dicer1是一种RNaseⅢ酶，能将pre-miRNA加工成较短的miRNA双链体，对于miRNA生物合成有重要作用[61]。Dicer的条件性卵巢组织特异性剔除的小鼠模型呈现不育、低卵巢重量、低排卵率、异常发情周期以及发育相关基因失调[62]，提示miRNA可能与女性不孕症有关。不孕症是多囊女性的临床表现之一。研究发现，与可育供体胚泡相比，来自多囊卵巢或男性因子不育患者的形态相似的胚泡表现出特异性异常的miRNA谱，hsa-let-7a和hsa-miR-24在来自多囊卵巢与男性因子的胚泡组均显著下降，hsa-miR-92、hsa-miR-93、hsa-miR-19a和hsa-miR-19b仅在来自多囊卵巢的胚泡组显著下降；对6种miRNA表达的热图分析表明，与可育供体相比，多囊卵巢女性囊胚的热图谱与男性因素不育夫妇的热图谱明显不同，而后两者彼此相似；此外，对细胞分化有重要意义的miR-19a靶基因ARIH2(ariadne homolog 2)的表达仅在PCOS组中表现出上调，miR-24的两个靶标[编码信使RNA衰变促进因子KHSRP(K-homology splicing regulatory protein)和转录因子NFAT5(nuclear factor of activated T cells 5)基因]在PCOS组和男性因子组均下调[63]。

4 miRNA作为PCOS的生物标志物和治疗靶点

在人血清中检测到大量的miRNA，由于稳定性和可及性，miRNA可用作PCOS的非侵入性生物标志物[64]。研究发现，在PCOS患者中，miR-222、miR-146a和miR-30c的血清水平升高，而miR-320水平降低，并且3种上调的miRNA组合可以比单一的miRNA更有效地识别疾病，受试者工作特征曲线下面积达0.852[65]。miR-146a变异的女性发生PCOS的风险较高[66]，miR-146a的过表达增加了DNA损伤频率并导致PCOS的发生[67]。另一项研究发现，PCOS患者的血清miR-122、miR-193b和miR-194与胰岛素敏感性明确相关，联合体质指数与miR-193b作为预测PCOS合并糖代谢受损概率的新指标，其受试者工作特征曲线下面积达0.752[68]。与健康受试者相比，PCOS女性血清中miR-23a和miR-23b水平降低[69]，其中miR-23a不受体质指数的影响，提示miR-23a比miR-23b更适合评估PCOS。Song等[70]发现，PCOS血清miR-6767-5p水平随空腹血糖升高、月经频率减少而下降，其靶向细胞周期和免疫系统，可能是诊断PCOS的生物标志物。在排卵治疗期间，合并PCOS的女性患卵巢过度刺激综合征的风险增加，血清miR-16可能比黄体生成素/卵泡刺激素对预测过度刺激综合征更有效[71]，其产生差异性表达的机制可能是通过靶向血管内皮生长因子A介导炎症反应。

5 小 结

近年来，关于PCOS女性miRNA表达的研究越来越多，但通过不同研究检测到的miRNA的表达谱是不完整和重叠的，这可能与PCOS的复杂性和异质性以及大多数研究中样本量的限制有关。此外，一个miRNA可能具有多个靶标，并且同一靶点的3′非翻译区可能受多个miRNA的调控，这使得该网络进一步复杂化。许多miRNA通过影响卵巢类固醇激素代谢紊乱、胰岛素抵抗、卵泡异常发育参与PCOS的病理生理过程。鉴定女性体液或组织中的特定miRNA改变及相互作用有助于更好地阐明PCOS的发病机制。根据现有研究，miRNA还可以用作生物标志物以鉴定PCOS中的亚表型。许多miRNA模拟物、抗miRNA寡核苷酸和小干扰RNA治疗剂正在开发中。但目前尚无治疗方案直接靶向PCOS中的miRNA，研究相关miRNA制剂可能为将来PCOS治疗提供新思路。