脑源性神经营养因子治疗脑梗死的研究进展

王奎，任建功

(兰州大学第二医院内分泌代谢科，兰州 730030)

脑梗死是一种严重的神经系统疾病，多发生于老年群体，通常起病急，若发生大面积梗死则病情危重。脑梗死的特征是脑部血液供应减少或阻断，导致病变部位的缺血缺氧及能量缺乏，最终导致细胞死亡及功能丧失。根据受损脑组织缺血和损伤情况，可将梗死部位分为中央部位的梗死灶核心与周围的缺血半暗带[1]。梗死灶核心区域的神经元仅在梗死发生数分钟内发生不可逆性坏死，而缺血半暗带是功能受损的缺血组织，有可能进一步发展为核心梗死区域，但也可能被挽救。脑梗死除了直接导致急性神经功能缺陷外，还可能出现缺血再灌注损伤以及其他认知和精神方面的慢性后果(如认知功能下降和脑卒中后抑郁)[2]。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是神经营养蛋白家族中的重要一员，在啮齿动物的中枢神经系统中广泛表达，在许多脑活动和功能中扮演着非常重要的角色，不仅能促进神经元的发育和分化、细胞存活及突触可塑性[3]，同时具有抗凋亡、抗氧化、抑制自噬等神经保护作用[4]。目前已有研究表明，BDNF的丢失与许多神经退行性疾病有关[5]，并检测到多种神经退行性疾病患者脑和血液中的BDNF水平降低[6]，而恢复或添加外源性BDNF显示出生理治疗效果[7]。BDNF可以通过多种途径保护受损伤的脑组织，并促进缺血后脑细胞的恢复，同时减少脑梗死缺血半暗带的扩散，降低脑卒中后抑郁的发生率[8]。现就BDNF治疗脑梗死的研究进展予以综述。

1 BDNF治疗脑梗死的机制

1.1脑梗死的细胞学机制 细胞凋亡、自噬和坏死是细胞死亡的3种主要方式。长期以来，脑梗死的缺血坏死被认为是一种细胞缺血缺氧后的被动性死亡，但20世纪90年代，有学者提出脑梗死所导致的细胞坏死也是细胞程序性凋亡的一种[9]，并且这种说法得到越来越多的证据支持[10]。脑梗死的发生包含一些重要的分子事件(如自由基过度生成、Ca2+超载和兴奋毒性)，这些事件导致细胞内稳态发生变化，进而可能引发坏死或凋亡。细胞凋亡可导致DNA断裂、细胞骨架和核蛋白降解、蛋白质交联、凋亡小体形成以及吞噬细胞受体配体表达，最后被吞噬细胞吸收[11]。而BDNF可通过抑制细胞凋亡因子活性、拮抗细胞内Ca2+超载、抑制兴奋性氨基酸、增强蛋白激酶C的活性、调节凋亡因子Bcl-2和Bax的表达、增强抗氧化酶的活性以及减轻氧自由基损伤等拮抗脑梗死所带来的损伤[12]。

1.2BDNF基因表达及其受体通路 BDNF蛋白由位于第11号染色体(11p13)上的BDNF基因编码。啮齿动物的BDNF基因包含多个启动子，每个启动子均位于外显子之前，通过选择性切片产生大量BDNF转录物，而这些转录物均包含编码BDNF蛋白的外显子[13]；转录物首先转录到BDNF-信使RNA，然后通过高尔基体和反面高尔基体网状结构将BDNF-信使RNA加工成BDNF前体和成熟BDNF[14]。随着发育和成年，BDNF可结合其高亲和力受体酪氨酸激酶B受体(tyrosine kinase receptor B，TrkB)或低亲和力受体p75神经营养因子受体，分别参与神经突起的生长和凋亡[15]。在静息状态下，TrkB受体和p75受体均位于细胞内小泡的膜上，Ca2+、环腺苷酸或电脉冲刺激均可启动这两种受体与细胞膜的转移和融合[16]。成熟的神经营养因子结合TrkB受体后可增加细胞存活和分化能力、增加树突棘复杂性、强化神经长时程增强功能、增强突触可塑性和神经网络的重塑能力等[17]。

磷酸化的TrkB可激活4种酶，即磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)、促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、磷脂酶C-γ和鸟苷三磷酸酶[18]。这4种酶相对应的通路及作用包括：PI3K/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)相关通路具有抗凋亡和促生存活性，并可调节N-甲基-D-天冬氨酸受体依赖的突触可塑性，PI3K/Akt/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白级联通过调节蛋白质合成和细胞骨架发育，促进树突生长和分支；MAPK/Ras信号级联可调节神经元分化过程中的蛋白质合成，这对基因表达的早期反应、细胞骨架蛋白合成以及海马神经元的树突生长和分支至关重要；磷脂酶C-γ依赖性途径激活Ca2+-钙调素依赖性蛋白激酶和蛋白激酶C，从而提高1，2-二酰甘油和Ca2+浓度，而蛋白激酶C依赖性通路可增强突触可塑性；BDNF/TrkB复合物可激活鸟苷三磷酸酶，刺激肌动蛋白和微管的合成，从而导致神经纤维的生长[19-20]。

2 外源性补充BDNF

2.1直接外周给药 直接外周给药是临床最普遍的给药方式，但对于BDNF而言，因受到血脑屏障通透性差、生物半衰期短、外周神经系统不良反应等限制，直接外周给药治疗脑梗死疗效甚微[21]。尽管鞘内给予BDNF可行，但缺乏临床疗效的证据[22]。

2.2脑室内注射给药 脑室内注射BDNF可直接提高中枢BDNF水平，但直接注射BDNF呈现大剂量释放，不能达到缓慢、稳定释放的目的。目前有两种方法可克服这一问题：在颅骨钻孔安装一固定微型泵，将外源性BDNF缓慢注射到脑室，有研究将此法应用于大脑中动脉闭塞的小鼠，从梗死前1 d至梗死后7 d持续注射BDNF，结果显示，BDNF治疗组和对照组的皮质梗死体积分别为(10.8±7.1) mm3和(37.9±19.8) mm3，证实了BDNF对脑卒中的神经保护作用[23]，此法可减小梗死体积，但因其有创以及有感染的可能，故临床应用有限。将BDNF嵌入水凝胶中，然后将BDNF/水凝胶注射到脑梗死中央部位，因水凝胶具有独特的溶胀和诱发不规则构象填充脑卒中病变部位的能力，且本身所具有的低毒性和抗炎特性，使其广泛用作微创给药的生物材料[21]。研究证实，BDNF/水凝胶可促进亚急性脑梗死小鼠的运动恢复，增加了梗死周围皮质脑卒中后的神经发生；且相对于直接给予BDNF在梗死灶1周的代谢时间，BDNF/水凝胶可持续释放BDNF 2～3周[24]。上述两种方法均避开血脑屏障直接给药，为有创性操作，且不能维持长期稳定的血药浓度，所以存在较明显的弊端，因此需要替代方案，尽可能地将治疗性BDNF直接安全地输送到损伤部位，并保持损伤部位持续稳定的BDNF浓度。

2.3病毒载体结构给药 病毒载体结构方法首先是构建携带BDNF基因的病毒载体，然后将携带BDNF相关基因的病毒载体转移至中枢，通过扩增及翻译BDNF蛋白，达到持续释放BDNF的目的，以提高中枢，尤其是损伤部位的BDNF水平。腺病毒因具备更低的基因组合风险和更高的感染多样性[25]，因此作为病毒载体的首选。有研究表明，无论是在体内还是体外，重组腺相关病毒载体(recombinant adeno-associated viral vector，rAAV)-BDNF均能保护神经元免受凋亡和坏死的影响，在感染rAAV-BDNF的大脑中动脉闭塞小鼠脑组织中，梗死体积显著减小[26]。另一项构建AAV-SYN-BDNF-EGFP(enhanced green fluorescent protein)载体结构的细胞毒性实验显示，原代海马培养物中神经网络的活性无任何变化[27]，提示这种治疗方法对周围的神经无明显不良反应。Zhang等[28]将pIRES2(protein internal ribosome entry site 2)-EGFP-BDNF质粒转染的骨髓间充质干细胞注入脑梗死大鼠侧脑室，结果显示，实验组大鼠神经功能恢复及突触素表达水平均升高。病毒载体结构方法可长期稳定提供BDNF，但病毒本身可能引发的毒性、炎症、突变及其他潜在的风险，为其长期的临床应用带来了挑战[29]。

2.4纳米载体结构给药 纳米载体是通过包封、吸附等手段，将药物或蛋白质整合于纳米材料中，形成药物纳米颗粒[30]，以确保在体内环境中稳定释放。但此类纳米颗粒的良好封闭性限制了其对受体的有效性，以至于无法到达特定部位释放药物，甚至常导致聚集、活性丧失或免疫原性等，而通过提取各种天然生物膜结合纳米载药系统以及根据药物本身性质制作纳米复合物这两种方法可达到特定部位释放的目的，并避免以上弊端[31]。有研究给予大脑中动脉闭塞小鼠聚乙二醇和聚谷氨酸二嵌段共聚物BDNF纳米颗粒复合物，结果发现，可显著减少脑组织损伤，且延迟治疗可改善认知记忆，降低脑卒中后抑郁表型[32]。纳米载体颗粒可随意通过血脑屏障，且对药物兼容性高，但纳米材料可能存在的毒性作用不可忽视。

3 多种通路的调节剂

3.1TrkB受体激动剂 提高中枢BDNF水平是一种治疗急性脑梗死的有效方法，但BDNF对神经的有益作用均通过TrkB受体介导，由于受到靶细胞TrkB受体下调和丢失的限制，通过升高BDNF水平的治疗方法的效果可能受到影响[33]。有研究通过激活TrkB受体，以提高BNDF利用率，从而达到治疗脑梗死的目的，如Andero等[34]发现，7，8-二羟基黄酮在体外小分子化学筛选中被鉴定为选择性TrkB受体激动剂，该化合物具有神经保护作用，在BFNF表达降低的小鼠模型中可挽救BDNF缺陷；同时，可减少大脑中动脉阻塞大鼠的缺血再灌注损伤[35]。

3.2BDNF-信使RNA表达激动剂 BDNF-信使RNA的表达受神经元活动的调节，而谷氨酸能突触的激活可增加大鼠海马切片中BDNF-信使RNA的表达，α-氨基-3-羟基-5-甲基异唑-4-丙酸受体激动剂诱导的突触活性增加，可导致海马和皮质中编码BDNF及TrkB信使RNA的水平短暂升高[36]。Clarkson等[37]的研究应用氨苄基CX1837激动α-氨基-3-羟基-5-甲基异唑-4-丙酸受体，以提高幼鼠BDNF水平，结果显示，所有小鼠均在脑卒中后表现出不同程度的运动恢复，且初步证明上述过程是通过糖原合成酶激酶-cAMP应答元件结合蛋白信号途径转导的。

另有一些天然物质的提取成分也在BDNF研究中受到关注。例如，虾青素治疗可使BDNF和神经生长因子信使RNA表达增加，改善急性脑梗死大鼠的神经功能，并减小梗死体积，减轻脑水肿[38]；小檗碱可通过激活BDNF-TrkB-PI3K/Akt信号通路，逆转大脑中动脉闭塞诱导的BDNF和TrkB水平的降低，同时降低凋亡相关蛋白水平，从而保护大脑免受大脑中动脉闭塞的进一步损伤[39]。

4 BDNF模拟肽

除天然BDNF在治疗脑梗死中的广泛研究外，外界合成的各种BNDF模拟肽(在结构上与天然BDNF略有差异，或仅包含BDNF的部分结构域)也能起到类似BDNF的作用或起到部分作用，促进TrkB受体磷酸化或者激活相应的通路。BDNF环1的类似物——模拟肽GSB-214能选择性激活PI3K/Akt通路[40]；BDNF环4的类似物——模拟肽GSB-106能同时激活PI3K/Akt和MAPK/胞外信号调节激酶两种信号通路[41]；BDNF环2的类似物——模拟肽GTS-201可选择性激活MAPK/胞外信号调节激酶信号通路[42]。这些不同的环状神经营养素结构与同一受体(TrkB受体)相互作用，可以选择性地激活受体后信号转导通路。有研究证明，GSB-214和GSB-106两种模拟物可减小大鼠短暂大脑中动脉闭塞后的脑梗死体积，并改善神经功能[40]。虽然目前已有多种BDNF模拟肽产生相应疗效，但对于各结合位点的作用及机制尚不明确。因此，目前通过模拟肽所收获的治疗效果不如天然BDNF所产生的治疗效果理想。

5 其他方式

除上述治疗方法外，还有多种研究方法。例如，重复经颅电刺激可使脑卒中患者BDNF水平升高，并激活TrkB信号通路，从而改善神经功能并减小梗死体积[43]。另外，预处理运动可减小脑卒中后的卒中体积、神经元凋亡和氧化应激，改善运动功能，提高BDNF的表达水平[44]。养阴通脑颗粒可改善大鼠大脑中动脉闭塞后神经功能缺损和梗死体积，上调BDNF和血管内皮生长因子水平[45]。睾酮可显著提高血清和脑组织中的BDNF水平，降低脑卒中引起的氧化应激的严重程度[46]。这些方法均能提高BDNF水平，也能够对脑梗死起到治疗作用，但具体机制目前尚不明确。

6 小 结

通过提高BDNF水平治疗脑梗死的方法多种多样，且均在动物实验中获得了显著的疗效，这为脑梗死的临床治疗提供了新的思路。此外，也有通过减少BDNF降解提高BDNF水平的方法，如聚唾液酸与BDNF特异性结合形成复合物而减少BDNF的降解，提高BDNF水平[47]。这种方法在治疗精神分裂症中有理想的疗效，但目前尚无治疗脑梗死的相关研究报道。近年来，表观遗传学和多态性也被用作诊断及预测脑卒中后恢复轨迹的工具，这些途径均为提高BDNF水平提供了思路。但目前相关研究大多为动物实验，暂无大量患者获益的相关证据，且多种相关治疗方法的具体作用机制尚不明确，同时潜在的风险和不良反应也不可忽视。