雌激素膜受体GPR30 在雌激素相关性肿瘤中的研究进展

杨清旭，谢铭

(遵义医科大学附属医院胃肠外科，贵州 遵义563000)

雌激素作为一种性激素，在女性生理过程的许多方面发挥着重要作用，尤其在生殖系统发育和维持正常生理变化中起着关键作用，同时也在多种病理生理过程中起重要作用，并参与保护绝经前女性健康，可降低多种与雌激素相关疾病的发病率。既往研究显示，雌激素在人体内发挥作用需要通过效应通路实现，目前主要的效应通路是由雌激素受体(estrogen receptor，ER)α、β 介导的基因组效应通路，被称为经典信号通路［1-2］。但通过对雌激素效应的不断研究，发现了区别于经典效应通路的非基因组效应通路，且其作用速度较基因组效应通路快［3］，因此雌激素非基因组效应的研究成为热点。对雌激素非基因组效应的研究发现，G 蛋白偶联雌激素受体(G protein-coupled estrogen receptor，GPER/GPR30)作为一种新型的7 次跨膜G 蛋白偶联雌激素膜受体，在雌激素非基因组效应中发挥主要作用，且与雌激素核受体ERα、ERβ 没有同源性［3-5］。因此，GPR30 是雌激素发挥非基因组作用的主要载体，其亚细胞结构定位及下游基因的表达是目前研究的重点内容。所以，GPR30 作为雌激素的一种受体，在雌激素依赖性疾病中的作用关系，特别是在雌激素依赖性肿瘤发生、发展中的作用已成为国内外学者研究的热点。现就GPR30 在雌激素相关性肿瘤中的研究进展予以综述。

1 GPR30 概述

1.1 GPR30 的发现 GPR30 属于G 蛋白偶联受体超家族成员之一，编码375 个氨基酸，组成7 个跨膜蛋白，GPR30 的理论分子质量约为40 000［6］。Pietras 和Szego［7］在研究子宫内膜时发现，细胞膜表面有雌激素结合位点，并最终由Carmeci 等［8］在人乳腺癌细胞中首次发现并确认GPR30 是一种新型的G 蛋白偶联受体。随后多个研究团队相继在不同的细胞中克隆出该蛋白，并根据文献中报告的孤儿受体的连续编号，采用了GPR30 的名称［8-9］。但是直到2006 年筛选出雌激素、ER 拮抗剂(ICI 182，780)及他莫昔芬等GPR30 配体后，GPR30 才被正式认为是雌激素膜受体，并在雌激素效应中发挥重要作用［10］。随后筛选鉴定出了GPR30 特异性的激动剂G1 和特异性拮抗剂G15，G1 和G15 的大量运用，促进了对GPR30 更深层次的认知。最终，国际基础和临床药理学联合会根据大部分的研究结果将GPR30 正式命名为GPER［11］。

1.2 GPR30 的组织定位 GPR30 几乎分布于全身各个器官组织，广泛分布于乳腺、卵巢、子宫、心脑血管系统、肺脏、骨组织等对雌激素敏感的系统/器官/组织中，并且广泛参与了恶性肿瘤、炎症反应、心脑血管病变、肥胖、免疫反应等雌激素相关性疾病的发生、发展过程［12-13］。

1.3 GPR30 的亚细胞水平定位 GPR30 在多种细胞中广泛表达，但GPR30 在细胞内的定位还存在争议。Thomas 等［14］发现，在SKBr3 乳腺癌细胞及转染了GPR30 的人胚肾细胞HEK293 中检测到氚标记的雌激素表达定位于细胞膜上;但后续多项研究表明，GPR30 主要表达于以内质网、高尔基体为主的膜性结构上［15-17］;而Zhao 等［18］实验显示，GPR30 除了在以内质网为主的膜性结构上高表达外，同时还可见于细胞膜和线粒体。Madeo 和Maggiolini［19］利用癌相关成纤维细胞(cancer associated fibroblasts，CAFs)实验时发现，GPR30 在细胞核内亦表达。Funakoshi 等［20］发现在宫颈癌与海马锥体细胞膜上的GPR30 在17β-雌二醇的作用下可“转位”到细胞质内膜性结构上。Cheng 等［21-22］的研究结果中均发现，细胞膜上的GPR30 在网格蛋白的介导下可以转移至内质网和高尔基体上;而Lenhart 等［23］的实验结果表明，在受体活性修饰蛋白3 的作用下，GPR30 同样可以从胞内膜结构转移至细胞膜上;最近，有研究显示，GPR30 受体以分子量为70 000 的中间体形式到达细胞表面，随后发生构成性内吞作用，并推测GPR30 在细胞内很可能是内质网中缓慢成熟的受体和从细胞表面衍生出来的内在受体的组合，并且GPR30 的最终去路还是回归在细胞膜上［24］。虽然上述研究结果之间存在差异，但却有着相关性，并且以上研究结果为进一步明确GPR30 的定位提供了新的证据。在进一步对受体活性的亚细胞定位上，N-结构域被认为是受体从内质网到质膜成熟的重要途径。最新的研究结果表明，GPR30 N 结构域残基Asn 44 是N-糖基化的，并且对质膜上活性受体的成熟至关重要，而N-结构域残基1-42 在这方面是可有可无的［24］。这一结果支持了GPR30 在质膜中的活性，为进一步阐明受体活性的亚细胞定位增加了证据。

2 GPR30 主要的信号通路

GPR30 与其配体介导的非基因组效应及其具体的信号通路到目前为止尚未完全阐明，主要的信号转导途径包括GPR30 的配体(如雌二醇、G1、Tamoxifen 和ICI 182，780)可穿过质膜与内质网上的GPR30 结合，促使G 蛋白的三聚体结构解离为α、β 及γ 亚基，其中α 亚基激活细胞膜上的腺苷酸环化酶，腺苷酸环化酶催化腺苷三磷酸生成环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)，随着细胞内cAMP 浓度增加，进而激活蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)，激活的PKA 使下游的激酶被激活，进而快速调节细胞的功能变化［25］。解离后的β 和γ 亚基使非受体酪氨酸蛋白激酶Src 磷酸化诱导基质金属蛋白酶的产生，进而使亲乙酰肝素结合的表皮生长因子释放游离的肝素结合表皮生长因子，并与表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)结合后，使EGFR 被激活，导致促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPKs)、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)和胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2)等多个信号因子被激活，从而影响细胞的增殖和分化［26］。同时，研究还发现，雌二醇与GPR30 结合后导致PI3K激活，活化后的PI3K 可诱导3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇在胞膜上聚集，进而将Akt 通过PH 结构域募集至膜磷脂上，然后，使Akt 上的氨基酸磷酸化而被激活，活化的Akt 使一氧化氮合酶磷酸化并催化L-精氨酸转化为一氧化氮［27］，一氧化氮的生成被认为是雌激素保护心脑血管的关键因素;此外，GPR30 解离后的α 亚基激活磷脂酶C，活化的磷脂酶C 会诱导三磷酸肌醇生成，三磷酸肌醇进而开放内质网上的钙离子(Ca2+)通道，导致Ca2+释放增加，从而通过调节细胞内Ca2+的变化而影响细胞的功能［28-29］。

3 GPR30 在肿瘤中的表达和作用

3.1 GPR30 与乳腺癌 根据乳腺癌的治疗指南，ER 阳性乳腺癌可以使用ER 拮抗剂他莫昔芬和芳香化酶抑制剂等内分泌疗法，但是对于ER 阴性乳腺癌则无益处［30］。然而，在ER 阳性乳腺癌患者治疗过程中发现，约有25%的患者对内分泌治疗效果不佳，甚至部分敏感的患者最终也产生了耐药［31］，因此内分泌治疗出现抵抗甚至耐药原因成为研究的热点。随着对GPR30 的深入研究，GPR30 在乳腺癌中潜在的作用逐渐被发现。研究证实，GPR30 在ER阳性的乳腺癌MCF-7 细胞和ER 阴性的SKBr3 细胞、人体乳腺癌灶组织细胞中均广泛表达［32-33］;Filardo等［33］研究结果显示，GPR30 的表达与临床和病理预后不良有关。同时，对炎性乳腺癌标本的研究显示，88 例标本中有69% 的标本GPR30 呈阳性表达，GPR30 的表达与ER 呈负相关［34］。但是同样有研究结果显示，GPR30 与ERα 的表达无关［35］，所以ER 与GPR30 的关系目前还存在着争论，同时也需要进一步的研究去解释这个问题。

有研究显示，利用乳腺癌细胞株MCF-7 ER 阳性进行实验时，GPR30 激动剂G1 通过激活ERK 1/2和EGFR 信号通路，增强MCF-7 乳腺癌细胞的迁移，而且拮抗剂G15 对此有明显的抑制作用［36-37］。同时，有实验证实，GPR30 是乳腺癌耐他莫昔芬的启动子［38］。但也有研究发现，GPR30 通过激活G 蛋白偶联的β 和γ 亚基(但没有激活cAMP 信号)，对ER 阳性的MCF-7 细胞的生长起抑制作用［39］。并且，G1和人类表皮生长因子受体2 抗体(EGFR 阻断剂)联合使用可以增强对乳腺癌细胞的抑制作用［40］。虽然，GPR30 在ER 阳性乳腺癌细胞中起促进作用还是抑制作用目前尚无定论，但是GPR30 可能是ER阳性乳腺癌和耐药乳腺癌潜在的一个治疗靶点。

临床资料显示，ER 阴性乳腺癌比ER 阳性乳腺癌恶性程度更高，乳腺癌ER 的缺乏与内分泌治疗效果不佳有关，在ER 阴性乳腺癌细胞中，GPR30 通过β、γ 亚基激活酪氨酸激酶Src，刺激受体的自磷酸化，启动MAPK/ERK1/2 和PI3K 信号途径，最终诱导增殖［41-42］。同时，有研究显示，植物雌激素通过分子途径WDR7-7/GPR30 下调GPR30 表达可抑制ERα 阴性乳腺癌细胞的增殖［43］。在三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)中，GPR30 与TNBC 的高度恶性直接相关，TNBC 对激素治疗或针对人类表皮生长因子受体2 的靶向治疗没有反应，然而，雌激素可通过GPR30 的β、γ 亚基蛋白与TNBC 细胞中的GPR30 直接相互作用，从而激活c-Src、ERKs 和cAMP/PKA 信号级联，从而诱导肿瘤细胞增殖［44］;但是最新的研究显示，雌二醇可通过降低GPR30 的表达而抑制TNBC 的生长［45］，提示GPR30 可能是调节肿瘤侵袭性行为的关键受体。事实上，TNBC 的耐药抵抗(特别是在绝经前的患者)与GPR30 的表达增加有关［46］。因此，GPR30 在ER 阴性及TNBC中起着重要作用，有可能是这两种乳腺癌潜在的治疗靶点。

此外，研究结果还显示，GPR30 可介导乳腺癌的炎症反应［47］，诱导乳腺腺体恶化［48］。GPR30 可通过肿瘤微环境中CAFs 发挥重要作用，Lappano 和Maggiolini［49］详细回顾了乳腺癌中CAFs 与GPR30的关系:GPR30 通过CAFs 分泌可溶性基质因子(如基质金属蛋白酶和细胞外基质成分)、诱导芳香化酶的表达、刺激雌激素水平的局部升高等参与了对他莫昔芬内分泌治疗的抵抗，从而支持GPR30 在乳腺肿瘤进展中的作用;GPR30 还通过促进CAFs 分泌白细胞介素-1β 和乳腺癌细胞表达白细胞介素-1R1，从而促进CAFs 与肿瘤细胞的相互作用;此外，活化的GPR30 促进成纤维细胞正向调节耐他莫昔芬乳腺癌细胞的上皮-间充质转化，从而促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭性;最后，GPR30 在乳腺CAFs 中的表达受低氧的调控，在雌激素刺激下，GPR30 与EGFR在乳腺肿瘤细胞核内共同定位。亦有研究显示，GPR30 在选择性ER 调节剂或芳香化酶抑制剂治疗耐药的乳腺癌细胞表达上调［50］。Kleuser 等［51］报道，雌激素和ICI 182，780 通过GPR30-MAPK 信号通路破坏了转化生长因子的信号网络和功能，转化生长因子信号通路的下调被认为是乳腺癌抗雌激素治疗的耐药机制。此外，双酚A 通过激活GPR30 降低化疗药物阿霉素、顺铂和长春新碱的有效性［52］。对于乳腺癌发生率较高的骨转移，Masuhara 等［53］确定，植物雌激素槲皮素可通过GPR30 抑制Akt 磷酸化的短暂增加，减少骨吸收和破骨作用。综上，GPR30 在乳腺癌的发生、发展及耐药过程中均有广泛参与，是影响乳腺癌综合治疗效果和预后的因素之一。

3.2 GPR30 与子宫内膜癌 乳腺癌治疗过程中出现的他莫昔芬效应是困扰临床医师的一个重要难题。随着对GPR30 发现及研究的深入，学者们开始关注GPR30 在子宫内膜癌中的潜在作用。Smith等［54］对47 例子宫内膜癌组织的研究结果显示，GPR30 的表达与EGFR 呈正相关，与孕激素受体呈负相关，GPR30 在肌层浸润范围广、病理分级高、组织学亚型较多的肿瘤中表达较多，且GPR30 蛋白水平升高与患者生存不良密切相关。还有研究结果显示，他莫昔芬对雌激素核受体有拮抗作用，但是对GPR30 却起激动作用，这可能是他莫昔芬治疗乳腺癌时产生耐药的原因之一，同时也解释了导致他莫昔芬效应产生的原因［55］。随着研究的深入，GPR30在子宫内膜癌中的作用已被逐渐揭开。GPR30 通过促进子宫内膜癌细胞的增殖和增强子宫内膜癌细胞的侵袭能力而参与子宫内膜癌的发生、发展。研究显示，GPR30 在子宫内膜癌中的表达显著高于正常子宫内膜，且GPR30 在Ishikawa ER 阳性和KLE ER阴性两种子宫内膜癌细胞株中均阳性表达［56］。此外，研究发现，在Ishikawa 和HEC1A 两种子宫内膜癌细胞系中，一种特异性的GPR30 反义寡核苷酸可消除对17β-雌二醇和羟基他莫昔芬的反应，而对照组寡核苷酸则无作用，并且转染GPR30 质粒的细胞内雌二醇和羟基他莫昔芬可诱导基因c-fos 表达，而转染空载体的对照细胞则无此作用，在MAPK 抑制剂PD 和PI3K 抑制剂WM 存在下，雌二醇或羟基他莫昔芬对子宫内膜癌细胞的增殖作用均被消除，提示GPR30 通过MAPK/PI3K 介导了子宫内膜癌细胞的增殖［57］。同时，Wei 等［56］研究显示，雌激素通过PI3K/Akt 信号通路调控雌激素核受体阴性子宫内膜癌细胞的增殖由细胞膜受体GPR30 介导。而Zhang 等［58］的实验结果也显示，GPR30 是雌二醇调节Gankyrin/PTEN/PI3K/Akt 信号转导和子宫内膜癌增殖所必需的。另外，Vivacqua 等［59］研究显示，子宫内膜癌细胞Ishikawa 中GPR30 的配体雌二醇、羟基他莫昔芬和G1 通过GPR30/EGFR/ERK 转导途径，激活早期生长反应因子1(early growth response factor-1，Egr-1)启动子序列，诱导Egr-1 表达;后续的研究也表明，GPR30 介导了Egr-1 在雌二醇、羟基他莫昔芬和G1 处理的CAFs 中的上调，进一步强调了GPR30 依赖的Egr-1 上调在肿瘤进展中的潜在作用。目前，在更深层面及最新的研究结果中发现，在子宫内膜癌细胞HEC1A(ER 阳性，GPR30 阳性)和AN3CA(ER 阴性，GPR30 阳性)中，雌激素和G1 作为GPR30 特异性激动剂上调转录因子苹果酸脱氢酶2 的表达，下调肿瘤抑制因子人第10 号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因的表达;相反，拮抗剂G15 下调了苹果酸脱氢酶2 的表达水平，表明雌激素通过激活GPR30 来刺激苹果酸脱氢酶2 的表达，从而促进子宫内膜癌细胞的增殖［60］。而Chen等［61］的研究表明，雌激素通过GPR30/PI3K/Akt 信号通路诱导蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1 升高，进一步影响子宫内膜癌细胞的生长。此外，Lv等［62］研究发现，胰岛素通过上调GPR30 的表达而促进雌二醇驱动的子宫内膜癌细胞增殖，其中胰岛素抵抗组子宫内膜组织中GPR30 表达显著增加;进一步研究显示，胰岛素上调蛋白tet 1 的表达，从而通过表观遗传调控上调GPR30 的表达。综上所述，GPR30 在子宫内膜癌组织和细胞均广泛表达，并且通过多种信号转导途径参与子宫内膜癌的发生、发展。随着研究的深入，GPR30 介导的子宫内膜癌细胞增殖的分子机制也将逐渐被揭开，GPR30 可能成为子宫内膜癌治疗的一个新的潜在靶点。

3.3 GPR30 与卵巢癌 雌激素与卵巢癌有着相关性，在应用雌激素抑制剂后的患者中仍有雌激素效应的产生。有研究显示，GPR30 在卵巢癌组织中广泛表达，参与了卵巢癌的增殖分化、局部浸润及转移过程［10］。Smith 等［63］的研究表明，GPR30 在上皮性卵巢癌的表达水平为80.0%，在良性卵巢肿瘤中为44.4%，而在正常卵巢组织中仅为25.0%。而且，有实验显示，随着EGFR、ERα 和ERβ 的表达，卵巢癌组织中GPR30 的表达显著高于癌周组织，进一步的研究表明，卵巢癌的低生存率与GPR30 的表达有关［64］。雌激素和G1 通过EGFR-MAPK 信号通路诱导卵巢癌细胞生长反应，同时在这一过程中需要ERα 的共同表达［65］。此外，GPR30 可通过增加基质金属蛋白酶9 的表达，促进卵巢癌细胞OVCAR5(ERα 阴性，GPR30 阳性)的迁移和侵袭［66］。Atrazine是最常见的农药污染物之一，它可通过GPR30 途径促进卵巢癌细胞的增殖，主要通过ERK 的诱导和雌激素靶基因的表达［67］。但也有其他研究结果表明，G1 可能通过抑制卵巢癌G2/M 期的细胞周期进程而抑制人卵巢癌细胞的增殖和诱导凋亡［68］。综上，GPR30 在卵巢癌中的作用可能为卵巢癌早期诊疗提供新的依据。

3.4 GPR30 与前列腺癌 雌激素可通过经典的ER 介导治疗晚期前列腺癌。雌激素核受体对前列腺癌生长和转移的影响在不同的细胞微环境中有不同的机制，GPR30 在良性前列腺增生前病变和正常区域的表达高于基底上皮细胞［69］。GPR30 在体外和体内通过ERK1/2 和c-Jun/c-fos 信号通路抑制多个前列腺癌细胞的生长，表明GPR30 可能是前列腺癌靶向治疗的新选择，G1 抑制去势耐药期，但对雄激素敏感肿瘤无影响，所以GPR30 是雄激素抑制的靶点［70］，可能为前列腺癌的治疗提供一个新的突破点。

3.5 GPR30 与结直肠癌(colorectal cancer，CRC)Bustos 等［71］在采用划痕法和Boyden 试验法进行迁移实验时发现，在常氧条件下，雌激素或G1 可以抑制HT-29 和DLD-1 两种CRC 细胞迁移及增殖，G15则增强了HT-29 和DLD-1 迁移，并限制了雌激素对迁移的抑制作用;在缺氧条件下，雌激素和G1 促进迁移及增殖，G15 抑制增殖;用小干扰RNA 剔除GPR30 重复上述实验发现，常氧下，雌激素和G1 在GPR30 沉默的细胞中丧失了抑制细胞迁移和增殖的能力，同时，雌激素和G1 对缺氧时增加细胞迁移及增殖的作用在GPR30 沉默的细胞中亦消失。由此发现，雌激素通过GPR30 介导在常氧期抑制CRC细胞的迁移及增殖，在缺氧时增强其迁移及增殖能力。后续实验发现，雌二醇在低氧条件下通过GPR30 上调缺氧诱导因子-1α 和血管内皮生长因子A 的表达，促进CRC 细胞的增殖和迁移［71］。这与在对低氧胚胎细胞的研究中发现的雌二醇增强缺氧诱导因子-1α 和血管内皮生长因子A 的表达结果一致［72］。另外，Bustos 等［71］研究还证实，雌激素及G1对HT-29 细胞ATM(抑制雌二醇的信使RNA)的抑制作用是通过GPR30 介导的，因为靶向GPR30 的小RNA 在信使RNA 和蛋白水平上阻断了雌激素对ATM 表达的影响;同时，在进行临床研究时发现，GPR30 表达与预后有关，对566 例患者进行Kaplan-Meier 基因芯片分析发现，高表达的GPR30 与Ⅲ期、Ⅳ期CRC 患者无复发生存率显著相关，而Ⅰ期或Ⅱ期男性和女性CRC 患者的生存率和GPR30 的表达无显著性差异;同时根据GPR30 的表达发现，Ⅲ期或Ⅳ期CRC 男性患者间无生存差异，表明GPR30在CRC 的进展和存活中的重要性和双态性。

3.6 GPR30 与其他肿瘤 GPR30 在多种肿瘤中均有过表达，而GPR30 信号通路的激活导致多种肿瘤的发生、发展。在肺癌中GPR30 的表达显著高于正常肺组织［73］。最新研究显示，雌激素可通过GPR30促进非小细胞肺癌增殖，免疫组织化学结果显示，GPR30 在非小细胞肺癌组织中高表达，GPR30 高表达与高分期、分化差、ER 高表达有关;用雌二醇、G1处理A549 和H1793 两种肺癌细胞后，GPR30 蛋白水平升高，但是加用抑制剂G15 后GPR30 蛋白水平降低;同时研究显示，G15 可通过抑制GPR30 逆转雌二醇或G1 诱导的细胞生长，用G15 阻断GPR30信号可能是非小细胞肺癌的一个新的治疗靶点［74］。Chevalier 等［75］的研究结果显示，双酚A 通过GPR30促进睾丸精原细胞瘤的增殖，从而诱导睾丸癌的发生。此外，还有研究结果显示，镉通过激活GPR30，诱导人甲状腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移，同时这种情况可被G15 所抑制［76］。而在对膀胱癌的研究中发现，雌二醇可通过GPR30 抑制膀胱癌细胞的生长［77］。虽然上述研究表明GPR30 在肿瘤的发生、发展过程中起作用，但仍需要更多的研究来揭示GPR30 在其他系统癌症中的作用和机制。

4 小 结

全世界针对恶性肿瘤的研究投入较大，但目前除了极少的恶性肿瘤有比较理想的治疗效果外，其余绝大多数恶性肿瘤治疗效果较差。虽然针对恶性肿瘤的研究很多，但缺乏一些重大的理论突破，所以这可能需要一些新的观点及理念的加入以促进对恶性肿瘤的研究。GPR30 作为一种雌激素膜受体，在受雌激素影响的疾病中有着重要作用。随着相关研究的逐步深入，人们对GPR30 介导影响的相关疾病，尤其在恶性肿瘤的发生、发展过程中的关系正成为国内外学者的研究热点，其具体作用的机制仍在不断发掘中，阐明GPR30 在恶性肿瘤中的功能和作用机制，将为雌激素相关性恶性肿瘤的治疗提供新的思路和策略。