葡聚糖在酶催化中的应用进展

杜雪飞,王文君,李雪玉,周 华

(南京工业大学生物与制药工程学院,江苏南京 211816)

基于绿色化学和可持续发展的理念,过去20年中生物技术得到了快速的发展[1]。酶是能够催化复杂化学反应的生物催化剂,具有高活性、高选择性和高特异性等优良的催化性能,已经在生物技术领域得到了广泛的应用。为进一步拓宽酶的应用领域,强化酶催化性能,提高酶活性和增加酶催化稳定性已成为近年来生物工程领域的研究热点[2]。糖是一类重要的化合物,它不只是简单的能源物质,还是参与生理和病理过程的重要信息分子,同时不同的糖类物质对酶的活性及催化稳定性均有不同程度的保护促进作用,如海藻糖对酶活性的保护作用已进行了较为深入的研究[3]。当前也有将葡聚糖应用于酶催化过程中的相关报道,本文将对葡聚糖在酶固定化和酶催化反应过程中的应用进展进行综述,分析葡聚糖对酶催化性能的影响因素,为葡聚糖在酶催化中的进一步应用奠定基础。

1 酶催化应用及存在问题

1.1 酶催化在各领域的应用概况

酶自古以来就被用于食品和饮料产品的生产,如奶酪、啤酒、白酒和醋等传统食品的制造。随着生物技术的不断进步,酶的应用已从食品领域逐渐扩展到医药、大宗化学品、日用化学品和环境保护等领域[4]。

1.1.1 酶在医药领域的应用 近年来,药物结构变得越来越复杂,制药过程的绿色化和环境友好性要求也越来越高,故寻找低成本、安全绿色的生物催化过程来替代传统的化学催化过程是发展趋势[5]。Ⅱ型糖尿病治疗药物西格列汀的合成,是近年来酶在制药工业中的一个重要的成功应用实例,筛选得到节杆菌中转氨酶用于西格列汀前体的不对称胺化,成功促使该药物成为DPP-4抑制剂中的首选药物[6]。阿托伐他汀是一类通过阻断肝脏中的胆固醇的合成来降低人体内胆固醇含量的一类药物[7],开发了两步法合成三种酶,包括乙酰丙醇脱卤酶、葡萄糖脱氢酶和还原酮酶,采用多酶级连的方法合成了阿托伐他汀的关键中间体羟基腈[8]。与传统化学法相比不仅减少了成本,还降低了对环境的污染[9]。

1.1.2 酶在食品领域的应用 目前酶技术已经广泛应用于乳制品、肉制品、饮料果汁、油脂等食品领域中。刘莹等[10]采用果胶酶、纤维素酶和木聚糖酶制备芒果混汁和苹果混汁,在降低酶用量的同时,温和的反应条件更好地保留了水果的营养成分,从而制备出了高出汁率、高营养的果汁。Yang等[11]研究发现,葡萄糖氧化酶与木瓜蛋白酶及木聚糖酶复合使用,能够催化面团中类胡萝卜素氧化,从而较好地改善面团褐变现象。随着人们对于食品安全及品质的日益注重,安全高效的酶制剂越来越受到食品生产者的青睐。

1.1.3 酶在日用化学品制造领域中的应用 相比于传统日化行业,利用酶来生产日化品不仅能够降低能耗,还有效减少了环境污染。蛋白酶作为胰腺提取物在洗涤剂中的应用历史悠久,最新研究[12]开发了能够在低温下使用的亲冷酶并应用到洗涤剂产品中,亲冷酶可在寒冷的环境中使用,其作用过程中不需要加热,这将有效的节约能源并降低环境压力。

1.1.4 酶在环境保护领域中的应用 有机农药的使用和大量的印染废水已成为当前工业领域最重要的水体污染之一,酶在环境保护领域中的应用已经逐渐受到重视[13]。漆酶能够催化含有发色基团的化合物如蒽醌、三芳基甲烷、靛青类和偶氮类染料等,因而常被用作生物漂白处理染料废水[14-15]。康从宝等[16]研究发现白腐漆酶在最适脱色条件下对活性蓝(RB亮蓝)的脱色率达到了90%,真菌表达的漆酶和氧化还原介体组成的漆酶介质系统,可以将靛蓝染料氧化为无色的靛红染料,并且可以减少用水量及污染物的产生。

1.2 酶催化应用过程中存在的问题

酶虽然能够在温和条件下进行催化反应,且具有很高的底物专一性和环境友好特点,然而应用于规模化产品制备过程中的酶来源较窄,空间结构相对柔性易失活,催化稳定性差,客观上限制了其应用的进一步扩大。因此增强酶的催化性能,提高其操作稳定性是当前酶工程领域研究的热点课题。

针对酶催化来源较窄的问题,近年来随着DNA重组和蛋白质工程技术的迅速发展,宏基因组技术、基因挖掘技术和酶的定向进化技术已经逐渐成为新酶筛选和改造的主流技术,已经有越来越多的高性能酶成功运用于酶催化过程中[17]。针对工业生产中酶活性低稳定性差的问题,目前研究主要集中于两方面:一是基于结构与功能的构效关系,从分子改造的角度进行酶活性改造;二是基于稳定酶催化活性中心的微环境出发[18],采用工程手段对酶的催化活性进行强化,包括酶的固定化、酶催化反应过程的调控等[19]。葡聚糖又被称为右旋糖苷,是一种由葡萄糖单体组成的以糖苷键相连的一种同型多糖[20]。近年来,关于葡聚糖在酶催化性能强化中的研究得到了越来越多的重视,下文将对葡聚糖在酶固定化和酶催化过程中应用展开具体综述。

2 葡聚糖在酶固定化中的应用

固定化酶是将生物酶链接固定到固体载体上,通过固体载体来限制生物酶三维结构变化,从而提高酶的储存稳定性、热稳定性(高温或低温)、操作稳定性(极端pH或有机溶剂)。同时固定载体的引入使酶可以从反应溶液中较为容易地分离出来,实现了催化剂的重复利用,有效促进了酶在工业生产中的运用[21-22]。

2.1 葡聚糖作为酶交联剂

酶与载体的连接方式会直接影响到固定化酶的活性的影响。由于空间位阻效应或构象限制,通过共价键直接固定化的酶即使固定率较高,但其活性和回收率通常较低。间隔臂的引入在一定程度上解决了这一问题。研究表明[23],通过乙二胺、盐酸乙二胺、琥珀酸酐和戊二醛等交联剂的作用,可以使固定化酶的活性回收率得到提高。但活性回收率的改善会受到交联剂链长的限制,由于短链交联剂对酶的交联限制了酶构象的完整展示,从而影响了酶催化活性的发挥,故利用长链交联剂对酶进行修饰交联,实现酶的柔性固定,能够显著提高固定化酶的催化活性和稳定性。

葡聚糖含有大量的羟基,具有较强的结合水能力,同时葡聚糖具有良好的生物相容性,其结构中含有的羟基可被氧化成醛基用于与酶表面氨基发生特异性反应。以醛基葡聚糖为交联剂对吸附固定的酶进一步交联,通过酶分子与葡聚糖在载体内部交联成网的方法提高固定化酶的结构稳定性。Ren等[24]研究发现,利用中空二氧化硅微球吸附固定脂肪酶CRL,并使用醛基葡聚糖进一步交联,脂肪酶的加载量线性增加至(171±3.4) mg/g,固定化CRL的热稳定性和对pH的耐受性均有显著提高,6次重复使用后剩余活性为82%±2.1%。Cesar等[25]以青霉素G酰化酶、羟腈裂解酶、乙醇脱氢酶和两种不同的腈酶为原料,用醛基葡聚糖经沉淀和交联制备交联酶聚合体(CLEAs),与戊二醛相比,以醛基葡聚糖为交联剂,酶活性损失显著降低。牟海霞[26]利用交联酶聚集体技术,采用醛基葡聚糖作为交联剂,对腈水合酶进行固定化,获得腈水合酶交联酶聚集体,酶活回收率为49.63%。同游离酶相比,固定化酶显示了有更好的pH、热稳定性、以及对高浓度底物的耐受性。这些研究表明了葡聚糖作为长链交联剂在酶固定化过程中能够保证固定化酶构象的完整性有效提高酶的催化活性、稳定性和酶的回收利用率。相比于其它交联剂,葡聚糖因其良好的生物相容性,多羟基长链结构,能够实现酶的柔性固定等特点,常被优先考虑应用到酶的交联固定化过程中。

2.2 葡聚糖作为载体修饰剂

固定化酶的活性在一定程度上依赖于固定化载体材料的物理化学特性[27],酶的固定化对载体材料有很高的要求。理想的载体材料应具备良好的机械强度、热稳定性和化学稳定性、耐生物降解性及对酶的高度亲和性、并能保持较高的酶活性等特点[28]。目前有很多研究尝试从酶固定化载体入手,对载体材料进行修饰以提高酶固定化的效率和稳定性。Goncalves等[29]首先用葡聚糖修饰二氧化硅载体,而后将葡萄糖苷酶固定在二氧化硅载体上,固定化葡聚糖糖苷酶热稳定性明显增强。刘瑶[30]用葡聚糖修饰过的磁性微球通过共价结合固定木瓜蛋白酶,研究表明木瓜蛋白酶固定在葡聚糖磁性微球上后,其活性中心没有受到明显影响,仍具有催化活性,而且对变性剂的抵抗能力大为提高。虽然目前关于葡聚糖在修饰酶固定化载体的报道相对较少,但这为研究者寻求强化酶催化性能手段提供了一种新的思路。

2.3 葡聚糖作为固定化添加剂

在固定化过程中酶的性能会受到很多因素的影响,如果处理不好,酶的活性、稳定性、选择性都会降低,可以在固定化过程中加入一些添加剂来保护酶活,使用的添加剂主要有牛血清蛋白、蛋白胨和葡聚糖等多糖类物质等[31-32]。近些年来很多学者尝试在酶固定化过程中添加一定浓度的糖醇类物质对酶进行保护以提高固定化酶的性能[33-34]。杨小民等[35]研究发现添加葡聚糖的纤维素酶的物理热变性温度可以提高到129.6 ℃,红外谱图和示差扫描量热谱图的结果表明,在高温下葡聚糖能形成玻璃态,能够有效地保护酶,并且随着温度的提高,葡聚糖和酶分子之间能更好地接触和混合,从而对酶的保护作用明显增加。周海燕等[36]以月桂酸与植物甾醇为底物,将葡聚糖与脂肪酶共吸附于大孔树脂中催化合成植物甾醇酯,考察其催化活性,固定化过程中加入质量7.5%的葡聚糖共吸附固定,酯化率达到了96.2%,比简单吸附的固定化酶反应时间缩短4 h。在酶的固定化过程中添加葡聚糖等多糖类物质作为保护剂,能够提高固定化酶的催化活性和对高温的耐受性,关于葡聚糖作为酶固定化过程中的保护性添加剂其保护性机理还没有得到科学具体的阐述,但相关研究都表明其作为添加剂对酶催化性能的提高起到了积极地作用。

2.4 葡聚糖作为酶修饰剂

蛋白多糖复合物在工业应用中具有重要意义[37-41]。用聚合物修饰酶蛋白可以显著提高酶在溶液中的稳定性,可为对冷冻敏感的酶蛋白提供低温保护。在用多糖对酶进行修饰时,形成额外的分子间和分子内桥可以提高酶的稳定性。其中利用葡聚糖对酶进行修饰是一种正在引起广泛关注和重视的方法[42],葡聚糖较好的水溶性和生物相容性,有助于维持酶制剂表面微量的水,保持固定化酶的稳定性和催化活性[43]。

Yapaoz等[44]合成了不同摩尔比的脲酶-醛基葡聚糖复合物,比较了该复合物与游离酶在pH、温度、热稳定性和贮存稳定性方面的差异,结果表明,在25、80 ℃时,酶活力分别比游离酶高1.4倍和2.5倍,复合物在有机溶剂介质中具有较高的催化活性,同时发现葡聚糖显著提高了脲酶的热稳定性和贮存稳定性。李苏等[45]将醛基葡聚糖连接到漆酶分子上,研究了漆酶在酸性溶液环境中的稳定性是否提高,结果表明通过葡聚糖修饰使得漆酶在pH3、50 ℃下的酶活半衰期从0.07 h提高到17.1 h,在含30%(体积)乙腈、pH3下的酶活半衰期从0.11 h提高到10.3 h。葡聚糖含有大量的羟基,具有较强的结合水的能力,醛基化后的葡聚糖作为修饰剂可与酶表面的氨基基团发生特异性反应,能够很好地改善酶的稳定性和催化活性。因此利用葡聚糖修饰酶成为目前提高酶催化性能和稳定性的一种有效的手段[46]。

3 葡聚糖在酶催化过程中的应用

3.1 葡聚糖在有机溶剂酶催化体系中的应用

有机溶剂酶催化体系所用的有机溶剂并不是绝对无水的,维持酶空间结构稳定的少量水是必须的[47]。在非水相酶催化反应体系中,当所用有机溶剂极性过强时,有机溶剂会剥夺酶分子表面微环境中的必需水从而使酶失活[48]。有学者研究表明[49],在有机相中加入某些添加剂如聚乙二醇、多元醇等多羟基化合物均可起到稳定酶活性的作用。糖类化合物含有大量的羟基,故在反应体系中加入一些糖类化合物可以很好地维持酶的表面水化作用,改善酶催化的微环境,有力促进酶催化能力的提升。Kajiwara等[50]利用葡聚糖对圆柱形念珠菌脂肪酶进行改性,将赖氨酸残基与羰基偶联,通过改变脂肪酶周围的微环境使酶在有机溶剂中亲水性增强;在pH8.0条件下,用葡聚糖改性的脂肪酶在25%(V/V)二甲基亚砜、乙醇、2-丙醇、甲苯和异辛烷中均表现出较高的稳定性。Cabrera等[51]通过离子交换将硫酸葡聚糖覆盖在脂肪酶CALB分子的表面,或用琥珀酸酐、1-乙基-3-碳二亚胺对酶进行琥珀酰化或氨化,酶在有机溶剂中对扁桃酸甲酯的选择性加,产物ee值(对映体过量百分数)从83%上升到了90%。葡聚糖在酶催化的有机溶剂反应体系中具有重要的作用,具有多羟基结构的葡聚糖能够维持酶蛋白表面微环境中的必需水,从而保证了酶在有机溶剂反应体系中活性的稳定。

3.2 葡聚糖在无溶剂酶催化体系中的应用

随着对酶催化反应体系研究的深入和不同学科之间的交叉,各种新的酶促反应体系也相继被应用于生产当中,其中无溶剂酶促反应体系是一类重要的非水相体系中酶促反应体系。

无溶剂酶催化反应体系以低熔点底物为反应溶剂,克服了有机溶剂毒性大、易挥发、产物不易分离等缺点,既降低了生产成本,又减少了对环境的污染,是酶催化领域中具有良好发展潜力的绿色环保工艺[52]。Bi等[53]以大孔树脂为载体,在无溶剂体系中固定化假丝酵母菌脂肪酶(CRL),采用葡聚糖在载体上柔性固定CRL,通过油酸与脂肪醇的酶酯化反应合成了油酸油酯,发现20000 Da葡聚糖固定化脂肪酶的效果最好,最佳反应条件下,酯的收率达到92.6%。无溶剂体系的低成本、低污染等特点使其成为工业生产中一种重要的绿色生产工艺,因而探求高催化效率的无溶剂酶催化体系具有重要的现实意义。目前的报道成功的说明了葡聚糖在无溶剂酶催化体系中的应用得到了认可。未来随着研究的深入,其应用会更加的广泛。

4 总结与展望

本文综述了葡聚糖在酶固定化和催化反应过程中的应用。在酶的固定化过程中,葡聚糖因其含有大量的羟基、较强的水合能力以及良好的生物相容性,可作为酶交联剂、酶及载体修饰剂用于酶的固定化过程之中,多项研究表明显著了提高了固定化酶的活性和催化稳定性。同时由于多羟基化合物对酶空间结构的稳定具有保护作用,故将葡聚糖作为保护性添加剂加入到酶的催化反应体系中,尤其是在有机溶剂反应体系中,葡聚糖能够减弱有机溶剂对酶分子表面微环境必需水的剥夺,有效维持了酶空间结构的稳定、提高了酶的催化性能;在无溶剂酶催化体系中,葡聚糖的添加也明显促进了酶催化效率的提高,为无溶剂酶催化这一环境友好反应体系的进一步推广应用奠定了基础。

虽然近年来葡聚糖在多个酶催化反应实例中得到了成功的应用,但葡聚糖在酶催化性能强化中的作用机理研究仍然存在诸多不足:如葡聚糖的加入如何影响酶的空间结构变化;葡聚糖如何影响酶表面微量水的浓度;不同分子量的葡聚糖对酶结构的稳定作用是否有差异;葡聚糖结构中羟基的醛基化率如何影响酶交联的效果等,都值得进行深入的研究。随着相关研究的不断深入,葡聚糖对酶催化性能强化的机理将会得到进一步的解析,葡聚糖在酶催化中的应用也将不断增加,为丰富多羟基化合物对酶催化稳定性作用机制的认识作出贡献。