p62蛋白在原发性骨肿瘤中作用机制的研究进展

刘姝，李东奇，叶帆，张晶

(昆明医科大学第三附属医院骨科，昆明 650118)

骨肿瘤是一种发生于骨骼或附属组织的肿瘤，分为良性和恶性两种类型，恶性骨肿瘤发展迅速、预后较差、病死率高。恶性骨肿瘤分为原发性骨肿瘤和继发性骨肿瘤，原发性骨肿瘤是指局部组织长出的恶性骨肿瘤，常见于多发性骨髓瘤(mutiple myeloma，MM)、骨肉瘤、骨巨细胞瘤。近年来，越来越多的学者将研究重心转向靶向治疗，随着靶向治疗的兴起，原发性骨肿瘤的治疗有了突破性进展，但也随之出现了新的问题，如靶向药物治疗后发生耐药[1]。靶向治疗的重点在于找到发挥关键作用的细胞及分子靶点。肿瘤的发生、发展往往是多种细胞、多个信号分子相互作用的结果。目前急需找到一种治疗靶点来预测靶向药物的治疗效果，所以针对p62靶点进行设计的治疗策略逐渐增多。p62是细胞内的一种多功能接头蛋白，包含多个功能结构域，与不同蛋白结合后可发挥不同作用，在细胞各种正常生理活动中有重要功能，研究显示下调p62蛋白表达能够抑制肿瘤增殖或转移[2-3]。目前已研发出p62的DNA疫苗(近年正在俄国进行Ⅰ、Ⅱ期临床试验)，在动物模型中能明显抑制多种肿瘤增殖及侵袭，且p62疫苗也可用于治疗炎症造成的骨质疏松[4-6]。p62蛋白与原发性骨肿瘤的关系密切，但具体作用机制不明确。现对p62蛋白及其在原发性骨肿瘤中作用机制的研究进展进行综述，旨在为原发性骨肿瘤的治疗提供新思路。

1 p62 蛋白

1.1p62基因结构及其蛋白功能 人类p62基因，也被称为SQSTM1，位于第5号染色体上的基因，包含8个外显子，可编码包含440个氨基酸残基的p62蛋白[7]。这些氨基酸序列包括Phox 和Bem1p结构域、锌指结构域、p38结合结构域、肿瘤坏死因子相关受体6结合结构域、核定位信号和核输出信号、微管相关蛋白1轻链3相互作用结构域、Kelch样环氧氯丙烷相互作用区域、泛素相关结构域等带有结构性模体的结构域。最初p62蛋白被发现是一种淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶[8]，现可作为非经典蛋白激酶C的结合伴侣[9]。p62蛋白分子结构中有多个功能结构域，可通过与其他蛋白质的相互作用来调控不同的信号通路，包括核因子E2相关因子(nuclear factor erythroid 2 related factor,Nrf)2、核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)和自噬等，参与细胞癌变过程[10-12]。

1.2p62蛋白与肿瘤的发生发展 近年来，许多研究显示p62蛋白与多种恶性肿瘤的发生发展关系密切，恶性肿瘤的发生发展主要表现在增殖、迁移及侵袭，p62蛋白可以影响多种肿瘤的增殖、迁移和侵袭来调控肿瘤的发生发展[13-16]。肿瘤p62蛋白功能结构域泛素相关结构域与微管相关蛋白1轻链3相互作用结构域突变体调节自噬通量并减弱胱天蛋白酶8的激活，在卵巢癌细胞中,自噬降解参与p62蛋白介导的胱天蛋白酶8激活[13]。p62蛋白在食管癌组织中高表达，p62蛋白在miR-487a敲除后显著上调，p62蛋白过表达显著改变了小鼠的增殖能力[14]。Iwadate等[15]通过对194例原位子宫内膜癌患者进行免疫组织化学及统计分析发现，高表达的p62蛋白参与了子宫内膜癌细胞的侵袭，细胞质p62蛋白的高表达有助于提高子宫内膜癌细胞对氧化应激的侵袭性和耐受性。小核仁RNA宿主基因16作为一种致癌长链非编码RNA，通过调节p62蛋白表达，进而激活下游磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白和NF-κB信号通路，促进肝癌细胞增殖、迁移和侵袭[16]。p62蛋白主要位于细胞质，在肿瘤组织中表达水平较高，部分恶性肿瘤细胞质中p62蛋白的积累预示着预后较差[17]。目前，对于p62蛋白调节肿瘤发生发展的机制尚无统一说法，普遍认为p62是一种多功能蛋白，可通过自噬、Nrf2、NF-κB等多种信号通路调节肿瘤的发生发展[18]。首先，受体蛋白p62与选择性自噬密切相关，p62蛋白的积累对肿瘤的发生至关重要，在肝癌中p62是一种异常积累的致癌蛋白，过表达可诱导肝癌并增加小鼠的肿瘤体积[2,19]。此外，自噬基因的敲除已被作为自噬的生理模型，缺乏必需自噬相关基因5和7的小鼠也会发生肝损伤、炎症和不能进展为癌的良性肝肿瘤[20]。其次，Saito等[21]研究表明，p62蛋白的Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1结构域结合Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1后阻碍Nrf2的激活，并增加肝癌对抗癌药物的敏感性，而且NF-κB负调节激活与癌症相关[22-23]。已有研究证实，NF-κB可通过影响肿瘤的增殖、浸润和转移调节肿瘤的恶性行为，介导促肿瘤生成相关基因的表达参与抗凋亡及细胞周期的调节[24-25]。综上，p62蛋白与肿瘤的发生发展关系密切，但具体机制仍不明确，可能是因为p62蛋白具有多个功能结构域，与不同信号分子相互作用所致。

1.3p62蛋白与骨代谢 骨新陈代谢的维持依赖于骨的吸收与骨形成之间的动态平衡，而这种平衡由成骨细胞和破骨细胞共同维持，其中破骨细胞在生理性和病理性骨吸收中发挥重要作用，有研究表明p62蛋白可通过平衡破骨与成骨细胞生成和限制炎症减轻骨代谢紊乱[6,26]。大多数原发性骨肿瘤都表现出溶骨性，长期以来，p62蛋白被认为是破骨细胞形成和活化的重要调节剂，适配器蛋白质p62蛋白参与NF-κB受体活化因子配体促进破骨细胞的形成、自噬或NF-κB通路激活[27]。p62基因突变被认为是Paget骨病(Paget disease of bone，PDB)的主要原因，PDB是由溶骨性病变和过度活性破骨细胞表征的骨骼疾病[28-29]。PDB突变主要发生于泛素相关结构域，常见突变位点为p62p394L，唑来膦酸在p62p394L的PDB小鼠模型中可预防PDB并加速骨丢失[30]。p62基因缺陷在体外加速破骨细胞形成，并导致小鼠PDB骨表型[31]。

2 p62蛋白与原发性骨肿瘤的关系

2.1p62蛋白与MM MM是一种以单克隆蛋白产生和溶解性骨病为特征的浆细胞恶性肿瘤。研究证实p62蛋白在MM进展中起重要作用[32]。骨髓微环境中的MM细胞可以增加破骨细胞的分化，造成骨损伤[33]。有文献报道通过XRK3F2(一种p62锌指结构域抑制剂)阻断p62锌指结构域依赖信号可以逆转MM诱导的Runt相关转录因子2抑制的表观遗传学机制，促进成骨分化[34]。锌指结构域与受体相互作用蛋白结合后，能够传感下游通过经典蛋白激酶C激活NF-κB[35]。目前普遍认为p62蛋白可通过调节NF-κB通路导致MM，研究表明蛋白酶体抑制剂硼替佐米可通过NF-κB治疗靶点发挥作用[36]。有学者认为，阻止硼替佐米诱发的NF-κB激活可阻断氯喹诱发自噬，减少核转录因子抑制蛋白退化和增强硼替佐米诱发淋巴瘤细胞的死亡[37]。NF-κB主要用于维持MM细胞生存，核转录因子抑制蛋白激酶复合物2抑制剂苯胺嘧啶衍生物AS602868能抑制NF-κB激活，诱导人MM细胞系的凋亡和阻断细胞周期进展以及抑制原发性MM细胞的存活，核转录因子抑制蛋白激酶复合物2抑制剂苯胺嘧啶衍生物AS602868单独使用或与传统药物联合使用，对MM患者有一定治疗价值[38]。也有报道显示，在MM新型LP-1细胞株的耐卡非佐米衍生物中p62泛素结合物受体水平升高与卡非佐米耐药有关，包括生存前自噬和Nrf2通路激活，阐明了MM细胞中蛋白稳定网络的复杂性，并为开发p62-Nrf2抑制剂作为克服晚期MM亚组患者蛋白酶体抑制剂耐药性的手段提供了临床前理论依据[39]。也有研究表明，Beclin-1和p62之间表达平衡对于MM细胞的存活非常关键，可以初步评估细胞对凋亡的敏感性，并且在体外自噬可以作为一种促进MM细胞存活的机制，平衡药物诱导的细胞死亡[40]。蛋白酶体抑制剂卡非佐米的耐药性与生存前自噬水平升高有关，而人锌指转录因子Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4，KLF4)被认为是促进因素，在获得性卡非佐米耐药的MM细胞中，KLF4蛋白的表达水平和核定位均升高，染色质免疫沉淀表明内源性KLF4与p62基因的启动子区域结合，该启动子区域编码连接蛋白酶体和自噬蛋白降解途径的泛素结合适配器蛋白隔离体p62[41]。然而，干扰p62信使RNA的表达导致自噬体无法捕获MM细胞中的泛素化载体，将生存前自噬转化细胞凋亡[42]。p62蛋白或自噬基因γ氨基丁酸A受体结合蛋白1的下调降低了蛋白酶体抑制后的细胞存活率，p62蛋白的诱导需要Nrf1，同时诱导蛋白酶体基因，暴露于蛋白酶体抑制剂20 h后，细胞通过Nrf1独立机制激活自噬和大多数自噬基因[32]。研究表明，p62蛋白丰度的降低可导致细胞内ATP显著减少、毒性显著、凋亡和集落形成，沉默p62蛋白的MM细胞系在2周内彻底死亡，相反，作为对照的2B淋巴瘤中p62蛋白的表达相对减少，导致相应细胞系很少或几乎没有死亡，细胞死亡前p62沉默的MM细胞系显著增加了对硼替佐米诱导的泛素化蛋白和毒性的敏感性，而且p62的减少没有影响独特的抗骨髓瘤药物阿霉素，说明p62蛋白在MM细胞系存活中发挥关键作用，并对蛋白酶体抑制剂产生特异性保护[43]。p62蛋白对于MM细胞系至关重要，是一种新的特异的骨髓瘤靶点，可能通过NF-κB信号通路或Nrf2或自噬通路发挥作用。

2.2p62蛋白与骨肉瘤 骨肉瘤是最常见的恶性骨肿瘤，好发于儿童和青少年，肺转移最常见。目前关于p62蛋白在骨肉瘤中表达程度以及通路仍存在争议。有学者采用免疫组织化学方法检测70例骨肉瘤石蜡样本，结果显示p62蛋白在77.1%(54/70)的样本中存在过表达，并且表达水平与肿瘤大小、转移、临床分期、预后不良显著相关[44]。另一项研究显示，p62蛋白的表达水平可能与骨肉瘤的复发、转移、预后密切相关，与原发性肿瘤组织相比，复发或转移性组织中p62蛋白表达降低[45]。两项研究中p62蛋白表达程度不同的原因可能是：前一项研究发现，在人类骨肉瘤细胞中，p62信使RNA和蛋白水平均上调，表明该蛋白调控发生在转录和翻译水平。后一项研究发现，在化疗过程中自噬活动会增强，p62可能作为一种自噬相关蛋白，而自噬系统不断降解p62。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2和MMP-9已被多项研究证实，可在骨肉瘤中通过降解细胞外基质和基膜的成分促进骨肉瘤细胞迁移和侵袭[46-48]。Yu等[49]研究发现，雷公藤红素通过抑制骨肉瘤细胞中磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/NF-κB信号通路下调MMP-2和MMP-9表达，负向调节骨肉瘤的侵袭及增殖，由此推测p62蛋白可能通过NF-κB信号通路在骨肉瘤中发挥作用。而雷公藤红素也可以通过自噬调节骨肉瘤细胞凋亡[50]。近年来，越来越多的骨肉瘤新治疗策略聚焦于调节失调的自噬[51-52]。巴西苏木素通过诱导自噬促进骨肉瘤细胞死亡，华蟾素通过活性氧类/c-Jun氨基端激酶/p38促分裂原活化的蛋白激酶信号通路诱导人骨肉瘤U2OS细胞自噬介导细胞死亡，三氧化二砷也可通过活性氧类转录因子EB信号通路诱导骨肉瘤细胞自噬性死亡[53-55]。氯喹可通过调节p62蛋白的表达阻断顺铂耐药骨肉瘤细胞的自噬过程[56]。自噬可以抑制阿霉素诱导的骨肉瘤细胞凋亡，在骨肉瘤U2OS和Saos-2细胞系中，自噬抑制可能是增加抗癌药物有效性的一种新策略[57]。综上，p62蛋白可能通过NF-κB信号通路或自噬来调节骨肉瘤发病。

2.3p62蛋白与骨巨细胞瘤 骨巨细胞瘤是一种交界性且具有局部侵袭性的骨肿瘤，特征为溶骨性病变，常见于股骨远端和胫骨近端，骨巨细胞瘤单独手术后复发率高达16.7%～39%，其中1%～3.2%可发生肉瘤样变或肺转移[58-61]。骨巨细胞瘤是溶骨性肿瘤，关键发病机制是破骨细胞活化[62]。长期以来，人们一直认为p62蛋白是破骨细胞形成和激活的重要调节剂。衔接蛋白p62通过自噬或NF-κB途径参与NF-κB受体活化因子配体诱导的破骨细胞的生成和的激活[27]。因此，p62蛋白可能通过激活自噬或NF-κB通路调控骨巨细胞瘤发病。

3 小 结

目前原发性骨肿瘤的治疗仍然依赖于手术、化疗和靶向治疗，随着化疗及靶向治疗药物的耐药性及不良反应的出现，对于晚期肿瘤及复发患者的治疗仍然存在瓶颈。p62是一种多功能接头蛋白，与不同的重要信号分子结合发挥不同的作用，在肿瘤的增殖、侵袭、转移过程中发挥重要作用，还可通过p62-Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1-Nrf2通路、NF-κB通路、自噬通路中一种或多种通路发挥作用，但具体机制仍不明确，生物学作用及意义仍需进一步研究。目前p62的靶向治疗已成为肿瘤治疗的研究热点，在多中心Ⅰ/Ⅱa临床试验中，已报道p62疫苗单次或联合化疗可使晚期实体肿瘤患者在8～32周内获得44%(12/27)的疾病稳定状态[63]。因此，p62蛋白有望成为原发性骨肿瘤发病的预测指标，为原发性骨肿瘤治疗提供新的思路，但仍需更多临床试验证实。