血管化复合同种异体移植物的免疫细胞亚群变化及基因谱表达

王晨羽 丁文蕴 龙 笑 王晓军

在过去的20年中，逐渐开始尝试使用由异体的皮肤、肌肉、肌腱、脂肪、血管、神经以及骨骼等多种组织组成的血管复合同种异体移植物(vascular composite allotransplant, VCA)对截肢、严重烧伤、颅面缺损、褥疮等原因导致的手部、面部和臀部等部位的大面积组织缺损进行移植修复重建[1]。相较于传统的修复重建手术，VCA可以有效改善局部和整体形态功能，患者术后的满意度和生活质量明显提高。然而，VCA移植术后存在着严重的免疫排斥问题，其复合组织的耐受性，特别是皮肤成分，极具挑战性，需要患者终身使用免疫抑制剂，但仍常出现急性或慢性排斥反应(上肢移植急性排斥率为88%，面部移植急性排斥率为73%，实体器官移植急性排斥率为10%～30%)，导致移植物死亡[2，3]。有关VCA移植的免疫学机制是近年来研究的热点，其中免疫细胞亚群的变化及相关基因谱表达的研究，对于理解VCA排斥反应发生的免疫机制和研究相关非侵袭性检查具有重要意义。

一、VCA免疫排斥机制

在VCA移植早期，主要引起的是细胞介导的急性排斥反应，亦是最常见、最主要的排斥反应，其依赖于通过抗原的直接和间接途径来启动T细胞识别。最常见的形式为不匹配的MHC分子反应，以CD8+细胞释放诱导移植细胞凋亡的细胞毒素攻击移植物细胞[4]。随着淋巴组织中抗原的初始暴露，抗体介导的免疫反应被激活。通过补体固定以及通过抗体依赖性细胞毒性的发生，以及自然杀伤细胞和巨噬细胞受体结合的抗体Fc区以诱导移植物细胞死亡[5]。当移植物进入慢性反应期间，炎症持续诱导内皮损伤，继而产生慢性平滑肌细胞重塑机化，形成外膜增厚、血管周围炎症和胶原蛋白过量沉积等病理改变[6]。

二、免疫细胞亚群变化

目前来看，对免疫细胞亚群进行定量分析可以借以评估移植后的机体免疫状态并有利于预防机会感染和恶性肿瘤。在肾脏和心脏移植的相关研究中发现，外周循环中的记忆T细胞数量与急性排斥反应的发生风险密切相关[7, 8]。外周血中活化的T细胞裂解的细胞产物的浓度水平可以预测移植后患者出现严重移植排斥反应的概率[9]。因此利用VCA的免疫细胞亚群的定量分析被认为是无创性临床检查技术发展的一个重要方向[10]。

1.外周血中的免疫细胞亚群：由于VCA急性排斥反应主要依赖于具有细胞毒性的T细胞，因此其亚群变化是首要的研究方向。有研究对6例接受全脸移植患者外周血中的淋巴细胞进行了表征，发现效应记忆T细胞是VCA移植后淋巴细胞的主要亚群。CD4效应记忆T细胞(CD45RA-CCR7-)是CD4+T细胞中的主要表型，而CD8+T细胞中则由效应记忆T细胞(CD45RA-CCR7-)和RA效应记忆T细胞主导。在大多数患者中，外周循环中主要的T辅助细胞(T helper，Th)类型是Th2细胞，其次是Th17和Th1细胞。发生排斥反应前后外周血液中的CD4+和CD8+T细胞数量没有显著变化，效应记忆T细胞亦无明显减少(CD45RA-CCR7-)，但CD4+和CD8+效应记忆RA T细胞(CD45RA+CCR7-)均增加。排斥反应期间，调节性T细胞(CD4+Foxp3+)在移植物中大量积累，导致外周循环中的调节性T细胞的数量减少[11]。

抗体介导的排斥反应与T细胞介导的排斥反应的免疫学特征有所不同，在T细胞介导的排斥反应中，CD8+群体中的T效应细胞数量增加，但是调节性T细胞数量没有变化。而在抗体介导的排斥反应中，外周循环中的Tfh细胞(CD4+PD1+CXCR5+)和记忆B细胞(CD19+CD27+)数量均增加[12]。

此外关于VCA和实体器官移植之间淋巴细胞亚群的差异也成为重要的研究方向。有研究比较了稳定的手部移植受者和稳定的肾脏移植受者外周血中的淋巴细胞亚群[13]。稳定的肾脏移植受者的外周血中B细胞数量较健康人减少了4倍，而稳定的手移植受者的B细胞数量与健康人比较则变化不大。手移植受者外周血中的调节性T细胞(CD4+CD25+CD127-)数量也与健康对照相似，但肾移植受者的调节性T细胞数量则显著减少。此外，手移植受者外周血中CD8+与CD28-T细胞数量亦显著增加。

2.移植物中的免疫细胞亚群：移植物中与外周血中的的免疫细胞亚群非常不同。与周围循环比较，VCA移植物的皮肤中存在着更多的T细胞，特别是有更多的效应记忆T细胞，以及分布有多种T细胞受体，并具有特征性的Th1表型。VCA移植物的皮肤中还有大量CD8+记忆T细胞[14]。排斥移植物的供体T细胞中，超过90%是组织定居记忆性T细胞(tissue-resident memory T cells, TRM)表型(CD69+、CD103+、CLA+)[15]。起初，当发生轻度排斥反应时，主要由CD3+T细胞浸润，并且CD8+细胞比CD4+细胞更为突出。真皮层内的CD3+T细胞的百分比和CD4/CD8的比率会随时间而增加，而CD20+B细胞则较为稀少[16]。转变为急性排斥反应时，大多数淋巴细胞是供体来源的CD8+记忆T细胞,并进一步表现为移植物中CD4+、CD8+和CD14+细胞的大量积聚[11，15]。

移植物内与受者体内其他部位的免疫细胞亚群亦有所不同。以手部移植为例，与患者自身皮肤比较，移植物的皮肤具有更多的CD8+淋巴细胞和CD68+巨噬细胞，但没有CD4+细胞。不论是否发生排斥反应，均在VCA移植物的皮肤中发现了CD20+B细胞，却未在自身皮肤中发现这一现象[17]。此外，VCA移植物的真皮和表皮中的树突状细胞均增加。班夫分级(Banff grade)1级反应的患者移植物真皮中的CD1a细胞数量亦增加。在面部移植中，移植物的表皮中仅有树突状CD8+T细胞作为供体细胞，而在皮脂腺和血管周围则存在着CD8+和CD4+T细胞作为混合供体和受体。

三、基因谱表达

通过鉴定细胞或组织中信使RNA的全部或部分基因的表达情况，可以估计大量基因之间的关联性，并探寻调控基因。基因谱表达在诊断疾病或探索机体对治疗的反应机制中起着重要作用。基于基因谱表达的临床及临床前研究可以进一步加深对VCA分子免疫学机制的认识[18]。

1.排斥相关基因：在出现排斥反应的面部移植患者体内，γ-干扰素(interferon-γ，IFN-γ)信号通路(包括IRF1和STAT1)被激活，然后通过CXCR3/CCR5通路(包括CXCL9和CCL5)产生趋化因子配体，继而上调负责募集细胞毒性细胞的基因的表达，激活由CD8+细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞的基因表达(包括GZMB)，实现免疫效应功能[12]。在人和动物模型中，IFN-γ已经被证明是同种异体移植排斥反应过程中促进炎症的关键因子，可以与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)协同发挥作用，诱导CXCR3配体(CXCL9、CXCL10、CXCL11)和CCR5配体(CCL3、CCL4、CCL5)的表达。后两种配体是同种异体移植急性排斥反应中最常见的上调趋化因子。这些由树突状细胞、活化的巨噬细胞、内皮细胞和NK细胞分泌的趋化因子，又可促进IFN-γ的产生增加，从而进一步促进炎性刺激的放大和趋化因子分子的释放[19]。

抗体介导的排斥(antibody-mediated rejection，AMR)和T细胞介导的排斥反应(T cell-mediated rejection，TCMR)的相关基因有所不同。AMR与血管内皮基因如细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule，ICAM-1)、VCAM1和SELE的过度表达有关，而TCMR的特征是与细胞毒性相关基因GZMB的表达上调有关[12, 20]。

基因谱表达显示，炎性皮肤疾病模型(接触性超敏反应)与急性皮肤排斥反应的发病机制有各自特征。皮肤中CCL7、IL-1β、IL-18和TNF的基因表达谱，在排斥反应模型与炎性皮肤疾病模型间存在明显差异。IL-12B、IL-17A和IL-1β基因表达水平在两种疾病模型之间比较，差异有统计学意义，并且表达水平与皮肤类型无关[21]。

VCA与实体器官移植的排斥反应基因谱也有所差异。与健康人比较，在手移植组中，排斥相关基因(CD8、IL-10、NOTCH1、PDCD1和TNF)明显上调。而肾脏移植组中，此类基因表达与健康人没有差异。此外，与肾脏移植组患者比较，手移植组中与排斥相关的基因(CD8、NOTCH、TNF)的表达水平也更高[13]。

2.耐受相关基因：叉头转录因子3(factor forkhead box 3, FOXP3)的表达可影响调节性T细胞的功能，例如CD25+FOXP3+T调节细胞在人自身免疫疾病发病机制中起重要作用。在VCA相关研究中，发现FOXP3与吲哚胺2,3-二加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)的表达水平与VCA排斥反应的严重程度密切相关[22]。IDO的表达在移植后3个月～1年最强，随后出现FOXP3+表达增多的趋势，表明FOXP3 mRNA水平与移植后的时间直接相关[16,23]。Jindal等[24]对接受hIL-2/Fc(一种持久的人白介素-2融合蛋白)处理的大鼠出现急性排斥反应时进行了皮肤活检，并比较了调节基因FOXP3和效应基因GZMB、IFN-γ和Prf1的表达情况。结果显示，这些基因的表达情况与VCA的长期耐受情况完全相关，即在长期存活的可逆性排斥情况下具有更高的调节/效应基因比。但是，目前仍不清楚FOXP3是否可以通过未知的独立途径来调节免疫反应，对此尚需进一步研究。

糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(glucocorticoid-induced tumour necrosis factor receptor, GITR)是一种参与抑制调节T细胞的活性并延长T效应细胞的存活的表面分子[25]。与稳定的肾脏移植接受者以及健康人比较，稳定的手移植接受者体内GITR明显上调[13]。与正常大鼠皮肤或同系移植物比较，大鼠同种异体移植物中白介素-18、TNF-α、CCL7、CCL17、CX3CL1、CXCL9、CXCL10和CXCL11的表达均显著上调，表明它们参与了适应性免疫反应[26]。

3.内皮黏附分子：目前研究显示，许多可以内皮黏附分子可以作为VCA免疫反应中的炎症相关基因。ICAM-1可以在白介素-1和TNF诱导下由血管内皮、巨噬细胞和淋巴细胞表达，继而激活涉及多种激酶的级联信号转导来产生炎症趋化作用。E-选择素、P-选择素和L-选择素可以起凝集素的作用，识别白细胞或内皮细胞表面的结构[27]。Hautz等[16]发现，在出现轻度排斥反应的手移植患者体内，黏附分子如淋巴球功能性抗原1(lymphocyte function-associated antigen 1，LFA-1)、ICAM-1、E-选择素、P-选择素和VE-钙黏着蛋白的表达上调，而对于P-选择素，其表达随移植时间的延长而增加。此外，Win等[12]也发现，出现抗体介导的急性面部移植排斥反应的患者移植物内表达增幅最大的是内皮黏附分子ICAM-1。

四、展 望

实体器官移植的大量研究提示了外周循环中的记忆T细胞数量与急性排斥反应的发生风险密切相关。而VCA移植后，外周循环中效应记忆T细胞是淋巴细胞的主要亚群，Th2细胞是主要的T辅助细胞类型。VCA由于其自身免疫特性，与周围循环比较，VCA移植物的皮肤中存在着数量更多的T细胞，具有更多样的效应记忆T细胞表型和T细胞受体，以及分布有特征性的Th1表型。基因谱表达方面，排斥相关基因主要包括IFN-γ通路、CXCR3(CXCL9、CXCL10、CXCL11)与 CCR5(CCL3、CCL4、CCL5)通路的相关基因，耐受相关基因主要为FOXP3和GITR。内皮黏附分子在炎症趋化反应中发挥重要作用，代表是ICAM-1、E-选择素、P-选择素和L-选择素。

VCA的免疫细胞亚群的变化及相关基因谱表达的临床研究对于理解VCA排斥反应发生的免疫机制和研究相关无创性检查具有重要意义。外周血中细胞产物的浓度水平、免疫细胞数量与表型的改变，相关排斥、耐受调节基因谱的表达变化，可以探索机体免疫反应的状态、预测移植后患者出现严重移植排斥反应的概率，研究个体对免疫治疗的反应机制，选择个性化免疫抑制方案。特别是在今后可据此开发非侵袭性的临床检测方式，实现在组织病理学检查前就可提示即将发生或已经发生排斥反应的目的。