细胞周期蛋白依赖性激酶5的生物学功能与相关疾病治疗

马宁，邢怡桥

(武汉大学人民医院眼科中心，武汉 430060)

细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)是一组结构相似且分子量为34 000～40 000的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。它们在生物进化中高度保守，存在于所有真核细胞生物中，并在各种细胞内普遍表达。每个CDK蛋白均有一个蛋白激酶结合口袋组成的催化中心、一个PSTAIRE-样与细胞周期蛋白结合的结构序列以及一个与CDK活化激酶结合的激活区域[1]。大多数CDK在细胞中通过与细胞周期蛋白结合，形成活性激酶复合物，进而参与调节细胞周期、调控DNA转录、信使RNA加工以及神经细胞的分化[2]。在CDK家族中，CDK5非常特殊，其激活物并不是细胞周期蛋白，主要生理作用也不是调控细胞周期，CDK5在增殖细胞和终末分化细胞均有激活。在早期研究中，仅在神经组织中发现CDK5被p35(CDK5活化剂1)激活，故认为CDK5与中枢神经系统的发育相关[3]。近年来，随着对CDK5的深入研究发现，CDK5不仅在多种实体和血液恶性肿瘤中上调并激活，也在血管形成以及胰岛素调节中发挥作用，并逐渐成为抗癌药物有希望的靶标之一。现就CDK5生物学功能以及相关疾病治疗的研究进展予以综述。

1 CDK5的特性和功能

1.1特征与结构 CDK5的蛋白质编码基因位于染色体7q36上，包括12个外显子。CDK5结构与CDK家族其他成员相似，具有PSTAIRE-样结构序列[4]，但也有许多方面与其他CDK不同。通常CDK需要与细胞周期蛋白结合后发挥生物活性，但与CDK5结合的为p35和p39(CDK5活化剂2)，p35、p39为同源蛋白质，翻译表达后位于细胞膜上，两者虽然可以直接与CDK5结合，但复合体不能释放入细胞质中发挥生理功能，必须转化为p25和p29形式，与CDK5相结合形成CDK5/p25、CDK5/p29后释放入细胞质[5]。与其他CDK相同，CDK5与p25、p29的结合位点也位于PSTAIRE-样结构，但p25和p29在非神经系统中的表达甚少，缺少两者并不影响细胞正常分裂增殖；另外，细胞周期蛋白与CDK结合后可以直接引发CDK的磷酸化，但CDK5/p25、CDK5/p29复合体还需经过多种酪氨酸激酶作用才能成功使CDK5磷酸化，从而产生活性[6]。

1.2生物学功能 CDK5对不同组织产生不同的生物学功能。在神经系统中，CDK5参与神经生长锥的形成，支持突触发生、神经突向外生长；正常情况下，哺乳动物中的CDK5在神经组织水平较高，其次为睾丸组织，在其他组织中均为低水平表达，且在神经组织中p35表达明显，CDK5激活活性高于其他组织[7]。在CDK5显性失活突变体中，可观察到中枢神经突触生长减慢、神经皮质板层结构倒错以及皮质层上层中间神经元堆积，说明CDK5与中枢神经发育、神经元迁移密切相关[8]。肌动蛋白结合蛋白(Drebrin)是一种在肌动蛋白丝侧面结合的捆绑蛋白，可促进肌动蛋白聚集以及神经元生长锥形成。研究发现，CDK5通过将Drebrin转化为开放构象，暴露其末端与结合蛋白微管关联蛋白RP/EB家族成员3(EB3)的结合位点，而Drebrin/EB3/CDK5在丝状伪足中将肌动蛋白与微管进行偶联，促进生长锥形成，是神经元树突棘形成的基础[9]。

同时，CDK5能影响血管、淋巴管的形成。Liebl等[10]通过抑制CDK5减少了体外培养内皮细胞的伪足形成以及小鼠角膜血管环形成。之后，Bosutti等[8]进一步证实，CDK5在脑微血管细胞中与p25结合促进血管生成。抑制CDK5后，非小细胞肺癌[11]、肝细胞癌[12]、骨肉瘤[13]体外以及体内的血管密度均有下降，肿瘤生长减缓。此外，CDK5对淋巴管的形成产生影响。Liebl等[14]在内皮组织特异性敲除CDK5小鼠中发现，全身淋巴管密度减小、管腔与瓣膜形态异常，而CDK5缺失对淋巴内皮细胞的大小、增殖和细胞周期几乎没有影响，似乎CDK5仅影响内皮细胞“成管”功能。进一步免疫印迹发现，CDK5影响叉头框蛋白C2磷酸化水平，而缺乏叉头框蛋白C2可导致淋巴管形成失败和淋巴重构[15]。

CDK5在中性粒细胞中激活，参与了炎症反应过程。在脂多糖诱导的小鼠急性全身炎症反应模型中，小鼠海马中的CDK5水平显著增高，而在药物抑制CDK5后，模型中的白细胞介素-6、白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α等水平显著降低[16]。Lee等[17]使用鸟苷三磷酸刺激中性粒细胞，发现波形蛋白磷酸化增强，波形蛋白与CDK5共定位，两者可以免疫共沉淀，而在抑制CDK5后，波形蛋白磷酸化水平降低，并降低了炎症反应中中性粒细胞的分泌功能和迁移能力。

2 CDK5在相关疾病治疗中的应用

2.1抗肿瘤治疗 肿瘤细胞具有生长失控、可以持续分裂增殖的特点，细胞周期相较正常细胞明显缩短，CDK是癌症研究的热点之一。其被发现在乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌等多种癌症细胞中异常表达，可促进实体肿瘤的血管、瘤体生长以及癌细胞转移[4]。在非小细胞肺癌患者中，CDK5表达增加的患者往往预后更差，癌症转移提前[18]。在动物和细胞实验中，抑制CDK5的表达或激活可以减少癌细胞的生长、降低迁移能力，使用CDK5抑制剂Roscovitine，可以降低非小细胞肺癌[11]、肝细胞癌[12]、骨肉瘤[13]动物模型的新生血管密度，抑制瘤体生长。而抑制或敲低CDK5，可减少人胰腺导管上皮细胞和胰腺癌细胞中CDK5/p25的异常激活，降低细胞的迁移能力，且使培养细胞的形态发生变化，细胞极性丧失[19]。在胃癌和肺癌的疾病模型中，抑制CDK5也能显著减少移植于小鼠癌细胞的转移[20-21]。

同时，CDK5还参与了线粒体凋亡途径，抑制CDK5可促进肿瘤细胞凋亡，从而发挥抗癌作用。NavaneethaKrishnan等[22]发现，敲除CDK5的乳腺癌细胞中活性氧类和钙离子水平显著高于正常细胞，线粒体出现去极化、碎片化，细胞凋亡显著增多；在使用环孢菌素A或萨菲菌素A关闭线粒体膜通透性转换孔后，敲除CDK5的细胞内活性氧类水平降低，线粒体去极化、细胞凋亡的现象减少，说明CDK5与线粒体膜通透性转换孔的功能有关，敲除CDK5可以导致线粒体膜通透性转换孔开放，诱导细胞出现凋亡。在非实体瘤中，CDK5抑制剂Dinaciclib对急性T淋巴细胞白血病细胞也产生显著的促凋亡作用，并延长了移植人急性T淋巴细胞白血病细胞小鼠的生存期，提高了存活率[23]。另外，CDK5还参与了癌症的发生。信号转导及转录激活因子3(signal transduction and activator of transcription 3，STAT3)作为重要的转录因子，其过度激活是癌变的原因，抑制STAT3可抑制肿瘤细胞的生长[24]。现已证实，在前列腺癌细胞、甲状腺髓样癌细胞中磷酸化的STAT3水平升高，抑制CDK5后STAT3的磷酸化水平下降，且减慢了肿瘤细胞在体内或体外的生长[25-26]。同时，Courapied等[27]在HT29结肠癌细胞中发现，CDK5与STAT3免疫共沉淀，可直接引发STAT3的磷酸化，并确定CDK5/STAT3途径通过下调DNA损伤修复基因Eme1的表达影响DNA修复，表明CDK5/STAT3通路参与了正常细胞到癌细胞的转变过程。此外，CDK5的活性抑制剂Roscovitine以及Dinaciclib在癌症治疗方面已进入临床试验阶段[28]，CDK5作为癌症治疗的新靶点值得期待。

2.2中枢神经系统退行性疾病治疗 中枢神经系统退行性疾病是一组由慢性进行性中枢神经组织退行性变性而产生的疾病的总称，是以大脑和脊髓神经系统中特定的神经元损伤、丢失为主要病理特征的疾病，包括阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症等。虽然病因及病变的部位各不相同，发病机制也尚不明确，但神经组织发生退行性病理学改变是其共同的特征。CDK5对神经系统发育的必要性，使其在神经系统疾病中的研究开展广泛。

帕金森病是一种主要表现为进行性锥体外系功能障碍的中枢神经系统退行性疾病。Binukumar 等[29]在小鼠黑质纹状体多巴胺能神经变性导致的帕金森病模型中，检测到CDK5/p25的过度激活；而使用来源于p25的TFP5短肽抑制CDK5/p25激活，可改善动物运动功能，减少体外培养细胞炎症与凋亡情况。为明确CDK5与帕金森病的联系，有学者对帕金森病患者的脑脊液和血清样品进行检测，结果发现，帕金森病激活炎症小体，导致神经系统中炎症因子增加；而在鱼藤酮诱导的小鼠帕金森病模型中对CDK5进行条件性敲除，发现敲除CDK5可以使白细胞介素-1β等炎症因子下调，抑制炎症小体产生[16]。这进一步明确了CDK5与帕金森病的联系，即CDK5在帕金森病中激活并导致炎症反应发生。另外，他莫昔芬作为成熟的乳腺癌、卵巢癌药物，人们试图了解其对CDK5是否产生影响，结果证明，他莫昔芬也可与p25相互作用以降低体内CDK5/p25的活性[30]。临床中他莫昔芬因为拮抗雌激素对神经元的保护作用，故在使用其治疗乳腺癌等疾病时，被认为会导致帕金森病患病风险增加[31]；而在左旋多巴诱发雄性大鼠帕金森病的实验中，他莫昔芬被证实有治疗效果[32]，但目前尚不清楚CDK5是否作用其中。

阿尔茨海默病的发病机制目前尚未完全明确，学术界比较认可的主要有Tau蛋白过度磷酸化和氧化应激学说、胆碱能学说、β-淀粉样蛋白毒性学说等。在阿尔茨海默病相关研究中，Watamura等[33]发现，正常情况下CDK5刺激威奥综合征蛋白家族富含脯氨酸同源蛋白1、脑衰反应调节蛋白2及Tau蛋白磷酸化，从而刺激轴突生长，但在病理情况下上述蛋白过度磷酸化激活，产生神经原纤维缠结，而神经原纤维缠结是阿尔茨海默病的主要病理变化。此外，在其他神经退行性病变，如hSOD1-G93A转基因小鼠模拟的肌萎缩性脊髓侧索硬化症模型中，也有CDK5和Tau蛋白的上调[34]。Tau蛋白可以促进细胞内微管的形成和稳定，一般认为Tau蛋白的过度表达和激活会使细胞中Tau蛋白聚集、微管结构紊乱，进而导致细胞骨架破坏、淀粉样蛋白产生，引起神经炎症，与帕金森病以及阿尔茨海默病的发生、发展高度相关[35]。CDK5作为一种新发现的Tau蛋白激活蛋白，在神经系统病变中意义重大。已有研究表明，神经系统发育过程中的神经元迁移和癌细胞迁移可能由非常相似的细胞和分子机制介导[36]，CDK5、Tau蛋白的异常激活引起神经原纤维缠结，而在癌症组织中CDK5、Tau蛋白也常异常表达[37]，但CDK5在两类疾病中的作用是否有相同之处或经由相同分子通路还需深入研究。

2.3抗青光眼治疗 青光眼作为致盲性眼病，以病理性眼压升高、视神经损害和视野缺损为特征，其中病理性眼压升高为主要危险因素，严重威胁着人类的视觉健康。CDK5与视神经的损害存在关联，抑制CDK5活性可以改善青光眼中视神经的损害。Chen等[38]通过烧灼巩膜外静脉诱发小鼠形成慢性青光眼发现，慢性青光眼小鼠视网膜中的CDK5、p25表达增加，对小鼠腹腔注射CDK5抑制剂Roscovitine后虽然不能降低眼压，但减少了视神经节细胞的凋亡。另外，在体外培养的视神经节细胞中构建糖氧剥夺模型，或添加衣霉素诱导细胞死亡发现，抑制CDK5均能降低细胞死亡率，保护细胞功能[39]。青光眼中视神经的损害与慢性神经退行性疾病有不少相似之处，但抑制CDK5在青光眼中的作用与CDK5在帕金森病等其他疾病中的作用机制是否相同，还需要进一步研究。

病理性高眼压是青光眼的重要危险因素，眼压升高是引起视神经、视野损害的重要因素。眼压越高，高眼压持续时间越长，导致视神经损害的危险性越大。有学者通过观察体外培养的猪眼小梁网细胞发现，加入CDK5抑制剂Roscovitine可以诱发细胞发生明显收缩；动物实验中，对兔使用Roscovitine滴眼可以降低眼压[40]。对CDK5的抑制可能通过促进小梁网组织收缩，使小梁网海绵样结构中的“孔洞”变大，房水更容易通过小梁网进入巩膜静脉窦，从而降低眼压。而在烧灼巩膜外静脉诱发的慢性青光眼模型中，Roscovitine并未降低眼压[38]，其原因可能为静脉回流已经被阻断，房水排出受到阻碍，故促进小梁网组织收缩并不能降低眼压。

青光眼中高眼压的机械压迫及其导致的低血流灌注，使视神经细胞处于缺血缺氧状态，纤维轴浆运输中断、神经营养因子供给缺乏，进而导致缺血再灌注损伤、细胞凋亡等一系列级联反应。Klinman和Holzbaur[41]在小鼠分离出的背根节神经元中观察轴浆运输，发现Roscovitine降低CDK5活性对轴浆运输几乎没有影响，但添加外援性p25增加CDK5活性显著减慢了轴浆运输的速度。可见，CDK5在青光眼模型中的异常激活可能是青光眼轴浆运输中断的原因之一。以上研究表明，CDK5与青光眼疾病发生、发展的各阶段均有密切联系。

2.4糖尿病治疗 胰岛素抵抗与胰岛素分泌减少是糖尿病发病的两个主要环节，对CDK5的干预可能同时促进胰岛素分泌增加、保护胰岛β细胞以及改善外周组织胰岛素敏感性。Zheng等[42]发现，在高浓度葡萄糖环境下(25 nmol/L)培养的Min6胰岛β细胞，较低葡萄糖环境下(3 nmol/L)细胞中CDK5/p25的活性升高；使用腺病毒转染过表达p25，Min6胰岛β细胞内CDK5/p25活性显著升高，受葡萄糖刺激后，胰岛素分泌显著少于正常细胞，也更容易发生凋亡；而进一步使用p35来源的CDK5活性抑制肽抑制CDK5/p25活性，成功逆转p25过表达细胞在高糖下的凋亡与低胰岛素释放。因此，抑制CDK5/p25活性可以保护胰岛β细胞功能，促进胰岛素释放。

L型电压依赖型钙离子通道是影响胰岛β细胞的重要离子通道之一。正常情况下，葡萄糖升高使胞质中的ATP增加，导致ATP敏感性钾通道关闭，细胞膜去极化，引起L型电压依赖型钙离子通道开放，钙离子内流并刺激胰岛素释放[43]。Wei等[44]在高糖环境下培养小鼠胰岛β细胞，并使用膜片钳观察细胞电位变化，结果发现，对CDK5的敲低或活性抑制导致细胞钙离子内流，胰岛素释放增加，在添加ATP敏感性钾通道开放剂二氮嗪后，抑制CDK5活性则不会引起胰岛素释放。此外，过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)是已知的调节外周组织胰岛素敏感性因子，在肥胖症小鼠脂肪组织中CDK5和PPARγ同时被激活；进一步研究发现，CDK5可以引起PPARγ第273位丝氨酸磷酸化，而罗格列酮等治疗糖尿病的药物可以抑制这种磷酸化发生，使用罗格列酮或Roscovitine治疗小鼠，均能降低小鼠脂肪组织中的PPARγ磷酸化水平，改善组织胰岛素敏感性[45]。

3 小 结

对CDK5的特性和功能以及CDK5在疾病治疗中的研究已取得一些成果。CDK5作为特殊的CDK蛋白，与多个系统、多种疾病的发生发展高度相关。CDK5通过与部分蛋白因子相互作用影响多种蛋白信号通路，且这些因子间有密切联系。CDK5抑制剂在疾病研究中已被证实可发挥良性作用，并有部分已进入临床试验。但目前有关CDK5的研究相对较少，研究时间尚短，且在不同实验中得出的结论尚不能肯定能发生在同一细胞内，很多分子间相互作用的机制也不十分明确。因此，应对CDK5的生理功能，尤其是作用机制进行深入研究，应充分借助现代生化技术，多途径、多靶点系统研究，从而有力促进人类健康。