透射电镜样品取材和固定应注意的若干问题*

周晨明 朱 艳 孟 丽 闫 静 徐彦楠

河北医科大学 1 电镜实验中心 2 教学实验中心，河北省石家庄市 050017

电子显微镜技术广泛应用于科研和医疗中，在日常的工作过程中经常会出现学生送的标本因取材或固定不当而影响最终超微结构的观察。取材固定是电镜样品制备的第一步，也是最关键的一步，直接影响观察结果。所以在此笔者对经常出现的问题进行分析总结。

1 取材前的准备工作

1.1 实验设计 大量阅读文献，明确实验目的，设计实验流程，合理安排取材时机[1]。戊二醛影响抗原性，若课题需要做免疫性的实验，就必须每组单独准备一只做电镜的动物。对于未进行灌流固定的动物最好先进行电镜标本的取材，以免组织自溶，影响超微结构的观察。实验动物要避免刺激以及环境的改变，尽量保持其生理状态，增加实验的可比性和可靠性[2]。取材时，务必做到相同条件下取材，相同人员平行操作，分别平行取每一组相同序号的动物[3]。一般每组动物至少取3份标本，避免个体差异，增加结论的可靠性。

1.2 固定液的选择 固定的作用是在分子水平上使细胞保存生活状态的超微结构，减少细胞死后的变化。化学固定剂可以和蛋白质结合形成交联，将蛋白质固定下来，也可以将糖、脂肪等物质保存在生存时的状态和位置，因此固定液的选择极为重要。

取材后固定的操作由学生进行，固定液的选择至关重要。一般细胞固定液为2.5%的戊二醛，组织固定液为4%的戊二醛，灌流固定选用3%多聚甲醛1%戊二醛，固定液应为清澈透明的液体，若见白色浑浊或絮状物则固定液不合格，影响最后的固定效果。固定液的酸碱度可以引起组织pH值的变化，不仅可以从根本上改变蛋白质等大分子物质的结构和性质，而且还会影响细胞质的化学成分、膜的大分子排列及酶的生物活性，所以固定液的酸碱度必须与被固定的组织酸碱度基本一致[4]。大多数动物组织酸碱度的平均值是7.4，所以固定液的pH值必须在7.2～7.4之间。

1.3 实验器械、标本固定容器的准备 固定组织的容器最好为青霉素小瓶，不宜使用Eppendorf 管，因为青霉素小瓶的底面比较大，组织可以充分地与固定液进行接触，固定效果更好。对取材用器材及试剂，进行清洁及预冷，写好取材的标签。

2 取材

2.1 正常对照组的取材 正常对照组应与模型组、治疗组同时取材。在工作中经常出现先用空白对照组进行练手，以致其结构变化，最终导致无法作为正常对照组。

2.2 组织标本的取材原则 组织标本的取材遵循快、小、轻、准、冷五原则。快：要求组织在断血1min内浸入固定液。取材时间过长，会出现细胞内溶酶体膜破裂，组织自溶。在操作过程中必须目标明确动作迅速，若多部位取材，须多人配合。小：没有方向的组织一般为取材尺寸为1mm×1mm×1mm，有方向的组织为1mm×1mm×3mm为宜，3mm为长轴的方向。因为固定液的穿透能力只有0.5mm，若样品过大会使内部固定不良；但也不能太小，样品过小时观察的目标将受到局限。轻：取材刀片要锋利，多选用双面剃须刀片，操作应始终贯彻动作轻柔。只做直线切割，避免对组织的挤压及拉锯，以免引起的组织结构的人工损伤性变化。准：部位准确可靠，根据研究目的要考虑到定位和定向的问题。冷：低温下操作，低温下保存，低温下送样。为了降低水解酶的活性，尽量在低温下操作，所用容器和器械应预冷，取好的标本放在4℃冰箱保存。送样时最好放到冰盒里，但应注意在小瓶与冰之间应用纱布隔开，以免固定液结冰，破坏细胞结构。

2.3 取材具体操作 将动物急性处死(或麻醉)，暴露出所需要的器官，用锋利的解剖剪剪取一小块组织，放在预先预冷的4%戊二醛固定液中。然后取出放在下面铺有冰袋的蜡板上，滴1滴预冷的固定液，用双面刀片将材料切成大约1mm宽，2～3mm长的小条，剪刀剪过的部位尽量不保留，对于没有定向要求的标本再将其切成约的1mm3小块。最后用牙签将组织块逐一放入固定液的小瓶中。放入4℃冰箱，固定2～4h。若不能及时往电镜室送样，每周更换固定液，放置最好不要超过2周。

2.4 特殊部位的取材 脑：因对缺氧比较敏感，所以最好先进行灌流固定，待组织硬化后进行取材。视网膜：常规的取材方法易造成视网膜组织脱离、皱褶，不符合电镜观察的要求。应该灌流固定后取整个眼球，将角膜剪开用注射器注入固定液，再将整个眼球放入固定液中固定。管状组织：取1cm左右的一段，再将两端上翻的组织用双面刀片去除，再进行固定。睾丸：因白膜下均为精曲小管，若取材太小则容易散开，所以取材应大一点，待固定一段时间后再进行修块，去除白膜，取白膜下的部分再进行固定。胰岛：若观察胰岛，取材应在胰腺的胰尾部。肺：因肺密度较小，固定时经常漂在上面，可以用小纱布将其包裹，再放入固定液中即可下沉。肾：若观察肾小球，应选择肾皮质部位进行取材。

2.5 培养细胞的取材固定 收集细胞的数量因细胞体积的大小而定，一般(2～5)×106即可。收集悬浮细胞时，将含有细胞的培养液倒入离心管，进行离心。贴壁细胞先将细胞从培养瓶或培养皿上轻轻地刮下来或者用胰酶消化下来，收集到离心管中离心。如果观察细胞凋亡，则应注意凋亡细胞或凋亡小体主要漂浮在培养液中，在收集样品过程中不能将培养液全部弃掉，应该将刮下的细胞和培养液中的细胞一同离心固定[5]。若仅保留贴壁细胞，将很难找到理想的凋亡细胞。

为了获得更理想的超微结构，可在离心前加入等量的2.5%的戊二醛，再进行离心。不同细胞离心转速和时间不同，应查阅文献进行确定。弃上清后沿管壁缓慢加入固定液，在4℃冰箱内静置固定1～2h，然后送样。若固定后，在送样时又散开，且再次离心不易成团，可以弃固定液，加入小滴10%牛血清白蛋白，再离心成团，再弃上清加固定液送样。

3 讨论

在多年电镜工作中发现，学生在做电镜实验中准备不充分，没有阅读文献，对自己实验目的不明确，前期实验设计不合理、取材操作不规范，导致后续工作都是徒劳。所以，作为电镜工作人员要做好前期的教学、帮助学生进行实验设计、指导取材等工作。身为学生，在电镜实验过程中，务必做到虚心学习、多查、多问、多思考、多练习，以使实验顺利完成。