microRNA在原发性高血压病理机制中的研究进展

朱丹，胡大春

(昆明医科大学附属甘美医院 昆明市第一人民医院检验科，昆明 650011)

原发性高血压(essential hypertension，EH)是心血管疾病的重要危险因素，根据2016年一份关于全球患高血压的人口研究报告，2000—2010年全球估计有13.9亿人患有高血压[1]。以往的研究已证明EH的病理过程累及多个器官[2]，随后针对EH病理机制和信号通路的药物和治疗策略得到发展，但EH病理机制复杂，目前其确切的病因与病理过程仍不清楚。研究认为，EH由基因遗传、生活行为和环境因素共同作用导致血压升高[3]。有关EH遗传病理机制的研究起初主要集中于基因组中的编码区域，但在人类基因组中编码蛋白区域在基因组总量中占比不足2%，其研究结果不足以完全解释血压升高的机制[4]。提示血压升高的病理机制中还存在不改变DNA序列但其表达性状切实发生改变的其他机制，即表观遗传学改变。表观遗传学的发生机制主要包括组蛋白修饰、DNA甲基化、染色质重构，特别是不编码蛋白质的RNA，即非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)对靶基因的调控等[5]。近年来，ncRNA作为细胞功能的基本调节因子得到广泛关注，在EH病理机制研究中也取得了许多新的进展。使用基因芯片技术发现高血压和正常血压受试者的肾皮质和髓质内的微RNA(microRNA,miRNA)在全基因组范围内具有差异性，提示ncRNA中miRNA可能在血压调节机制中发挥作用[6]。现就miRNA在EH病理机制中的可能作用进行综述。

1 miRNA及其作用机制

1.1ncRNA的分类 ncRNA根据分子大小不同可分为3种类型[7]：①短链ncRNA，其长度约20个核苷酸，包括小干扰RNA、miRNA、与PIWI蛋白相作用的RNA和小向导RNA。其中与PIWI蛋白相作用的RNA在动物生殖细胞中与Argonaute蛋白家族中PIWI蛋白特异性结合后介导靶mRNA降解[8]。②中长度ncRNA，长度为20～200个核苷酸，包括核仁RNA、与转录起始位点相关的RNA和启动子RNA，它们参与蛋白生物合成过程中mRNA的剪接。③长链ncRNA，其长度>200个核苷酸。此外，线性RNA的3′端和5′端可以连接形成环状RNA，环状RNA是新近发现的一类ncRNA，具有较好的稳定性和高度保守性，在许多生物学过程中发挥重要作用[9]。以往研究认为蛋白质编码基因是细胞表型和生物学功能的决定因素，然而随着对人类基因组及其功能表达的深入探讨与认识，发现ncRNA对基因表达及其功能实现发挥着重要的调节作用[5]。

1.2miRNA的生成与作用机制 在细胞核内RNA聚合酶Ⅱ转录miRNA的宿主基因，最初的转录产物为具有帽子结构(m7GpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的原始miRNA，原始miRNA在Drosha核酸酶和其辅助因子的作用下，被处理成含70个核苷酸的具有茎环结构的前体miRNA，前体miRNA再由RNA-鸟苷三磷酸和输出蛋白5将其输送到细胞质中，随后，由另一个核酸酶Dicer将其剪切，产生约为22个核苷酸长度的双链结构，即miRNA/miRNA*。这种双链很快被引导进入RNA诱导的沉默复合体中，其中一条成熟的单链miRNA保留在RNA诱导的沉默复合体中，另一条成熟的miRNA通过碱基配对结合到其靶mRNA的互补结合位点，进而促进靶mRNA的降解或抑制靶mRNA的翻译，发挥调控蛋白表达的作用。miRNA抑制靶基因表达的机制既复杂又具有非特异性，即一种miRNA可调控多个靶mRNA分子，一种mRNA也可被多种miRNA同时调控[10]。miRNA作为重要的蛋白表达调节分子，参与生命过程中一系列的重要进程，包括胚胎发育、细胞增殖、细胞凋亡、病毒防御、脂肪代谢、肿瘤发生等。研究表明，miRNA分子可作为诊断疾病的分子标志物，具有指导临床治疗潜能[11]。

2 EH病理机制中miRNA对肾素-血管紧张素-醛固酮系统作用的影响

2.1肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin aldosterone system，RAAS)对血压的调节作用 RAAS是调节血压的最重要因素之一。在RAAS中，球旁器上皮细胞合成前肾素原，其进一步加工形成活性肾素，肾素将肝脏释放的血管紧张素原转换为血管紧张素(angiotensin,Ang)Ⅰ；内皮细胞释放血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme,ACE)，将AngⅠ转化为AngⅡ；AngⅡ作用于血管紧张素Ⅱ受体1(angiotensin Ⅱ receptor type 1，AT1R)和AT2R；AngⅡ与AT1R结合，引起水钠潴留，血管收缩，刺激交感神经系统兴奋，刺激肾上腺皮质球状带释放醛固酮[12]。醛固酮是RAAS的终末激素，AngⅡ和细胞外K+浓度增加，促进了编码醛固酮合酶CYP11B2基因的表达，进而刺激醛固酮分泌[13]。醛固酮在远曲小管和集合管上皮细胞通过钠-氢交换、钠-钾交换，促进钠离子和水分子的重吸收，在肾脏的“压力-钠利尿现象”中发挥重要的生理调节作用。RAAS异常可导致AngⅡ水平升高，从而使血管收缩性增强、水钠潴留，进而导致血压升高；AngⅡ水平升高也是高血压肾损伤的重要因素之一。

2.2多种miRNA参与AngⅡ的血压调节及EH并发症的病理机制 多项研究认为，AngⅡ水平异常升高可诱导血管损伤，血管内皮细胞功能紊乱和血管重塑，进一步促进EH的发生发展与终末器官损伤[14-15]。Huo等[16]在研究AngⅡ导致血管损伤的机制中发现，连续14 d输注AngⅡ的小鼠，在血压升高的同时肠系膜动脉受损，使用测序技术对肠系膜动脉miRNA谱进行分析发现23种miRNAs水平上调，12种miRNAs水平下调，其中miR-431-5p是AngⅡ诱导血管损伤和血压升高的关键调节分子，敲除miR-431-5p表达可延缓AngⅡ诱导的血压升高并减轻血管损伤。提示miR-431-5p可能参与RAAS异常所致高水平AngⅡ的作用机制，降低miR-431-5p水平，有助于控制血压。

肾素受体是近年来受到广泛关注的RAAS新成员，高血压患者血浆肾素受体水平升高。有研究发现高水平的肾素受体可促进AngⅡ产生[17-18]。在对AngⅡ依赖性高血压动物模型的研究中发现，敲除肾素受体基因可抑制AngⅡ的产生及其诱导的血压升高；对人脐静脉内皮细胞进行研究显示，肾素受体mRNA的3′非翻译区(untranslated region，UTR)是miR-133a的作用部位，可负调控肾素受体表达；同时发现，miR-133a水平处于下调状态时，AngⅡ可导致收缩压升高，miR-133a表达增加，AngⅡ效应显著降低，miR-133a水平与AngⅡ效应存在负相关[19]。这些结果提示，miR-133a一方面可能通过调控肾素受体的表达调节AngⅡ水平；另一方面还可能抑制AngⅡ效应的发挥，对维持正常血压有重要作用。

有研究显示，EH患者中miR-126a-3p[20]和miR-150-5p[21]水平降低。Qian等[22]在研究绿茶的主要有效成分表没食子儿茶素没食子酸酯对血压的调节机制时发现其能有效降低自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHRs)的血压，并通过对SHRs颈动脉组织miRNA谱分析发现给予表没食子儿茶素没食子酸酯后miR-126a-3p和miR-150-5p基因表达增加；但miR-126a-3p的靶基因血管细胞黏附分子1、miR-150-5p靶基因特异性蛋白1及其下游分子AT1R的mRNA和蛋白表达均下调。提示正常情况下，miR-126a-3p和miR-150-5p可能通过降低血管细胞黏附分子1和特异性蛋白1的表达下调AT1R的表达，具有平衡AngⅡ升高血压的作用。

有研究显示，AngⅡ升高可诱导高血压肾病的发生发展[23]。一项对AngⅡ诱导肾损伤的研究发现，高血压肾病患者血浆与尿液中miR-103a-3p水平显著高于健康对照组，且与尿微量白蛋白呈正相关，进一步的动物实验研究发现，miR-103a-3p过表达可引起单核细胞驱动因子蛋白1、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6、白细胞介素-8等炎症因子在mRNA和蛋白水平的表达增加，提示miR-103a-3p上调参与AngⅡ诱导肾脏炎症和损伤过程[24]。经肾小球内皮细胞的转染实验和动物水平的研究均发现miR-103a-3p以蔗糖非发酵相关丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(sucrose non-fermentable-related serine/threonine-protein kinase，SNRK)为调控靶点，负性调控SNRK的表达，SNRK与核因子κB/p65相互作用后具有抗炎作用[24]。上述研究提示，Ang Ⅱ 可能增加miR-103a-3p的表达，下调SNRK水平，导致核因子κB/p65通路过度激活，诱发肾脏炎性损伤，这可能是高水平AngⅡ导致肾损伤的分子病理机制之一。

3 EH病理机制中miRNA参与血管平滑肌细胞表型转化

3.1血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)表型转化在血压调节中的作用 VSMCs高度分化，生理情况下VSMCs处于舒缩表型，以维持血管正常的舒缩活动。在病理条件下，VSMCs增生、肥大并向内膜下迁移，导致血管壁变厚、管腔变窄，血管阻力增加，是高血压形成的重要机制之一。

VSMCs内游离钙浓度增加，促进肌动蛋白-肌球蛋白交联桥的形成，使血管平滑肌收缩，血管平滑肌的收缩功能也受RhoA-Rho激酶、蛋白激酶C和促分裂原活化的蛋白激酶信号、活性氧类和肌动蛋白骨架重组的影响；免疫/炎症通路的激活和ncRNA是血管功能的重要调节因子[25]。VSMCs信号紊乱和功能改变可影响血管的反应性与张力，这是血管阻力增加和血压升高的重要决定因素。

3.2不同miRNA以不同机制影响VSMCs表型转换 钙调蛋白和α-平滑肌肌动蛋白是VSMCs舒缩表型标志物，骨桥蛋白是VSMCs去分化标志物。Liao等[26]通过运动降血压的实验研究发现，运动可显著降低收缩压，增加钙调蛋白水平，降低骨桥蛋白水平，提示运动有利于VSMCs向舒缩型转化。进一步研究发现运动可恢复miR-145水平，后者可增加VSMCs钙调蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的表达，但降低骨桥蛋白水平。继续进行转染实验发现miR-145可影响蛋白激酶B信号通路中胰岛素样生长因子1受体和胰岛素受体底物1表达，提示miR-145可能通过蛋白激酶B信号通路参与VSMCs舒缩表型的维持，有对抗血压升高的效应。

Wang等[27]研究发现高血压患者血浆miR-21-3p水平降低，且与收缩压或舒张压水平呈负相关，高血压治疗效果不明显患者的miR-21-3p水平更低，在SHRs中同样存在此现象，提示miR-21-3p可能参与血压的调节。深入研究发现α2B-肾上腺素能受体(α2B-adrenergic receptor，ADRA2B)是miR-21-3p重要的生理调节靶点，miR-21-3p可直接结合ADRA2B mRNA 3′UTR，抑制其蛋白表达。ADRA2B可诱导VSMCs从舒缩型向合成型转变，促使血管VSMCs增生，发生血管重构，致使血压升高，而miR-21-3p通过抑制ADRA2B蛋白表达，从而减弱血管重构的效应，具有对抗血压升高的作用。

在高血压血管重构中，过度的周期性血管壁牵张是血压升高的重要原因。过度的周期性血管壁牵张可促进VSMCs增殖。Wang等[28]研究发现增加周期性血管壁牵张，动脉VSMCs中结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)蛋白水平随之升高；敲低CTGF表达，VSMCs增殖减弱；注入重组CTGF蛋白可刺激VSMCs向增殖表型转变。深入探讨其机制发现miR-19b-3p可与CTGF的 mRNA 3′UTR结合，负向调节CTGF表达，进而减少VSMCs增殖，具有抑制高血压血管重构的作用。

血管外膜成纤维细胞是维持血管壁功能和结构正常的重要调控因子。胞外囊泡是细胞释放的磷脂膜囊泡，在正常和疾病状态下发挥着细胞与细胞之间传递信息的关键作用[29-31]。有研究者在正常血压WKY大鼠和SHRs的主动脉外膜成纤维细胞中分离出胞外囊泡，在两种大鼠体内注射WKY大鼠的胞外囊泡，发现可增加SHRs血管内的miR-155-5p水平，降低ACE的mRNA和蛋白含量，抑制血管重构，有利于降低SHRs的血压，WKY大鼠的血压无明显变化；再在两种大鼠体内注射SHRs的胞外囊泡，发现可降低两种大鼠的miR-155-5p水平，升高ACE蛋白含量，促进血管重构及血压升高[32]。提示动脉外膜成纤维细胞中的miR-155-5p和ACE含量与VSMCs增殖有关，且影响血压水平。

p27是一种细胞周期依赖性激酶抑制剂，在调节细胞周期，特别是G1期中起关键作用。p27通过抑制细胞周期蛋白E-细胞周期蛋白依赖激酶2和细胞周期蛋白D-细胞周期蛋白依赖激酶4等G1期激酶复合物的活化，阻断细胞从G1期进入S期，从而阻滞细胞周期，抑制细胞增殖[33]。Ki-67是一种存在于增殖细胞的核抗原，与染色质相连和细胞有丝分裂有关，是目前应用最广泛的细胞增殖标志物之一。对模型高血压大鼠胸主动脉VSMCs转染实验研究发现miR-155可靶向负调控p27蛋白表达，VSMCs的收缩标志物α平滑肌肌动蛋白同时降低，而Ki-67水平显著上调[34]。提示miR-155可通过下调细胞周期依赖性激酶抑制剂促进VSMCs增殖，参与高血压的形成机制。

4 EH病理机制中miRNA对内皮细胞功能的影响

4.1内皮细胞在血压调节中的作用 血管内皮功能障碍与高血压密切相关，内皮细胞的功能是向血液中释放血管扩张剂以减少血管阻力，其在血管系统的发育、调节和重构中发挥重要作用，血压升高可改变内皮细胞的表型和功能[35]。随着内皮功能障碍加重，血管舒张能力减弱，炎症因子的激活和释放，活性氧类的增加，NO减少，血管硬度和脉压增加，最终导致血压持续升高。内皮细胞表型的维持涉及多种分子机制，如蛋白激酶、整合素、内皮型一氧化氮合酶、NO、血管内皮生长因子和miRNA等[36-37]。有证据表明，miRNA参与血管生成、内皮细胞的增殖及其内皮细胞的功能障碍[38]。

4.2miRNA影响内皮细胞功能平衡稳态机制 高血压可加速血管老化，血管老化是高血压后期损伤靶器官的基础。血管老化的病理过程包括血管氧化应激增加、血管周围炎症增加、内皮功能障碍。内皮细胞功能障碍进一步加重血管硬化，与高血压引起的周围血管纤维化密切相关。Nosalski等[39]在高血压小鼠的血管周围组织(perivascular tissues，PVAT)中发现miR-214水平明显升高，敲除小鼠体内miR-214能改善小鼠的内皮功能障碍、降低血管氧化应激反应以及抑制T细胞进入PVAT，以减弱炎症反应；进一步研究显示，敲除miR-214可阻止促纤维化T细胞因子和趋化因子受体活化，从而减弱T细胞趋化作用，减轻血管周围炎症，提示miR-214通过增加PVAT内的T细胞数量和促进局部促纤维化细胞因子的释放，加重内皮功能障碍和周围血管纤维化，导致血压持续升高，表明敲除miR-214有利于血压的稳定和内皮功能的修复[39]。

Tian等[40]采用实时荧光定量聚合酶链反应技术对不同高血压分级患者外周血miR-199a-5p水平进行检测发现，EH患者外周血miR-199a-5p水平明显高于健康人群，且高血压分级越高，miR-199a-5p水平升高越显著，提示miR-199a-5p水平与高血压进展相关；进一步用人脐静脉内皮细胞转染miR-199a-5p可增加细胞凋亡率，而显著降低细胞自噬；且通过腺苷酸激酶/unc-51类似的自噬激活激酶1信号通路可抑制人脐静脉内皮细胞自噬，并促进其凋亡。提示miR-199a-5p可能通过影响血管内皮细胞自噬与凋亡机制，破坏血管内皮细胞的正常新陈代谢，使血管的顺应性调节失衡，促进高血压的发生发展。

以往研究表明，miR-122是哺乳动物中具有肝脏特异性的miRNA，来源于前体mRNA，即“hcr基因”，miR-122可与高亲和力阳离子氨基酸转运蛋白-1(cationic amino acid transporter-1，CAT-1)的3′UTR端结合，从而降低CAT-1表达[41]。一项病例对照试验发现，EH患者血浆中miR-122显著升高，CAT-1水平显著降低；且在年轻的EH患者(年龄<40岁)中更为明显。血管内皮细胞中的内皮型一氧化氮合酶依赖于CAT-1转运L-精氨酸进而产生NO[42]。可以推测，miR-122可能通过抑制CAT-1蛋白的表达，降低对L-精氨酸的转运，从而影响内皮细胞NO合成与释放，减弱血管的舒缓作用，促使血压持续升高。

5 miRNA在EH其他病理机制中的作用

亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrote reductase,MTHFR)在叶酸代谢通路中将5,10-亚甲基四氢叶酸转化为具有生物学功能的5-甲基四氢叶酸，后者进入甲基传递通路，通过同型半胱氨酸的重新甲基化过程间接为DNA甲基化、氨基酸甲基化等提供甲基,并且使血液中的同型半胱氨酸水平保持在一个较低的水平。流行病学研究显示，MTHFR 677C>T基因变异者患高血压的风险增加24%～87%[43]。Lynch等[44]检测了75例具有潜在心血管疾病患者的血压及MTHFR基因多态性分型，发现MTHFR 677TT基因型携带者血压均高于MTHFR 677CC基因型，且接近高血压的诊断标准；进一步分析75例患者血清中的68个miRNA相对表达水平，发现在TT基因型与CC基因型样本中miR-199-5p表达存在差异，与CC基因型样本相比，TT基因型样本中miR-199-5p水平增加了1.47倍，其中，收缩压低的TT基因型携带者miR-199-5p表达水平高于收缩压高的TT基因型。提示miR-199a参与MTHFR677C>T基因变异导致的血压变化。

紧密连接蛋白claudin是细胞间紧密连接的骨架蛋白，claudin家族有多个成员，且具有组织和器官特异性，claudin缺乏或异常表达与多种疾病相关。Matsuoka等[45]的研究显示，miR-124可与claudin结构域1(claudin domain-containing 1，CLDND1)的3′UTR结合，并在易患脑卒中SHRs的大脑和小脑中发现CLDND1 mRNA和蛋白水平明显高于WKY，而miR-124水平则明显低于WKY组，CLDND1 mRNA水平随着miR-124的降低而升高；进一步对人脑内皮细胞转染miR-124可使CLDND1 mRNA水平降低。这些结果提示，miR-124通过与CLDNL1 mRNA相互作用，负调控CLDND1表达，在高血压病脑血管并发症的发生中可能发挥作用。

血管升压素(arginine vasopressin,AVP)由下丘脑视上核与室旁核的神经细胞分泌。AVP与肾远曲小管和集合管的特异性受体结合形成复合物，激活腺苷酸环化酶，使ATP转变成cAMP，在cAMP的作用下激活蛋白激酶，使膜蛋白磷酸化，增加肾小管上皮细胞对水分子的通透性，水分子沿着渗透梯度被动地重吸收，对血容量的维持有重要作用。有研究显示，AVP与血管升压素受体1A(arginine vasopressin receptor 1A，AVPR1A)结合，可引发外周血管收缩，导致血压升高[46]。Nossent等[47]研究发现AVPR1A 3′UTR的rs11174811多态性中，TT基因型患者血压显著高于GG和GT基因型患者，进一步研究显示hsa-miR-526b和hsa-miR-578能够抑制AVPR1A的表达，但AVPR1A的G等位基因突变为T等位基因时这种抑制作用消失。提示AVPR1A基因rs11174811位点多态性可能影响miRNA对AVPR1A表达的调节作用。

6 小 结

传统观点认为编码蛋白质的基因可以调节特定细胞的表型和生物学功能，但越来越多的证据表明，ncRNA参与编码蛋白基因的表达调控，已成为影响DNA和表观遗传之间相互作用的动态管理器。因此，ncRNA在许多生物学过程中发挥重要作用。对EH病理机制的深入研究显示，ncRNA中的miRNA广泛参与EH的病理机制。miRNA在EH病理机制中的作用具有双面性：一方面，部分miRNA有利于血压的控制，能延缓高血压病并发症的发生；另一方面，部分miRNA促进高血压的发生发展，加重靶器官的损伤。因此，miRNA参与血压的调节机制错综复杂，不同的miRNA有不同的作用机制，所对应的临床治疗策略也应有所差别。