EB病毒潜伏期膜蛋白1与自身免疫性疾病关系的研究进展

(青岛大学附属医院风湿免疫科，山东 青岛 266003)

自身免疫性疾病是环境因素作用于遗传易感个体导致的固有免疫和适应性免疫多个环节异常而引发的自身免疫损伤性疾病。多种病毒和细菌感染参与自身免疫性疾病的发生与发展，如肠道菌群失调为炎症性肠病、类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)的发病诱因[1-2]；人巨细胞病毒感染与系统性红斑狼疮(SLE)、系统性硬化(SSc)有关[3]。EB病毒(EBV)是一种广泛流行于人群中的人类疱疹病毒，研究表明EBV感染与SLE、干燥综合征(SS)、MS、RA等多种自身免疫性疾病相关[4-5]。EBV潜伏期膜蛋白1(LMP1)基因是引起EBV致瘤性的关键基因，LMP1为EBV编码的表达于EBV感染细胞膜表面的蛋白，参与多种自身免疫性疾病相关细胞因子如B淋巴细胞活化因子(BAFF)、B淋巴细胞表面标志物CD23、干扰素(IFN)等的调控[6-9]，可以模拟CD4+T细胞表面CD40配体从而促进B淋巴细胞活化与分化[10]。本文主要总结EBV的感染特点，梳理LMP1在自身免疫性疾病的发生发展中的作用及其机制。

1 EBV的结构及EBV感染的特点

EBV为人类疱疹病毒Ⅳ型，是长为172 000 bp的线性双链DNA，衣壳呈二十面体立体对称，其衣壳主要由相对分子质量分别为160 000、47 000以及28 000的一组蛋白构成，包膜为脂质双层膜。其基因组编码的主要抗原包括：病毒衣壳抗原(VCA)、早期抗原(EA)、核抗原(EBNA)、LMP、膜抗原(MA)和小分子非编码核糖核酸(EBER)、BamHI-A片段转录产物(BART)等。EBV广泛流行于人群中，全球多数人口呈EBV潜伏性感染状态[11-12]。

EBV主要通过唾液接触传播。发生于儿童时期的EBV原发性感染通常表现为轻症或无症状；青春期或成人期获得的原发性感染可引起传染性单核细胞增多症[13]。EBV的外膜糖蛋白gp350/220能够特异性识别和结合B淋巴细胞表面分子CD21，通过受体介导的细胞内吞作用进入被感染细胞，其余种类的EBV膜糖蛋白如gp85、gp42等也参与病毒的穿膜与吸附等过程[14]，使得人B淋巴细胞成为EBV感染的靶细胞。在原发性感染发生后，EBV以潜伏感染形式存在于记忆B淋巴细胞中，逃避宿主免疫系统并防止受感染的细胞凋亡[15]，一旦宿主免疫力低下或环境发生改变时，EBV可被激活从而大量复制产生新的病毒个体，进而感染上皮细胞、淋巴细胞与自然杀伤细胞[16]，EBV侵犯上皮细胞的途径也可能通过病毒外膜糖蛋白与CD21分子的结合来完成。EBV在淋巴细胞和上皮细胞发生的复杂感染状态，是导致多种自身免疫性疾病与淋巴瘤等疾病的机制。

大部分慢性EBV感染者处于潜伏期感染状态。潜伏期感染指大约1/10万～1/万的B淋巴细胞感染，但部分细胞中的病毒不进行复制与繁衍，仅表达10余种基因产物[17]，这种病毒产物低表达的现象是EBV能够逃避免疫监视、造成潜伏期感染状态的一个因素，导致EBV在体内长期存在而不被清除。潜伏期感染分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型3种类型，每一种类型见于不同的疾病且表达的病毒基因产物有所不同。Ⅰ型潜伏感染EBV仅表达EBNA1、EBER、BART，常见于BURKITT淋巴瘤；Ⅱ型潜伏感染EBV同时表达LMP1、LMP2、EBNA1、EBER、BART，可见于霍奇金淋巴瘤、胃癌、鼻咽癌、NK/T细胞淋巴瘤，其中LMP1的表达是Ⅱ期潜伏期感染的标志[18]；Ⅲ型潜伏感染EBV表达更多基因产物，包括EBNA2、EBNA3A-C在内的全部潜伏蛋白，见于免疫母细胞性淋巴瘤、淋巴组织增生性疾病(PTLPD)、传染性单核细胞增多症、弥漫性大B细胞淋巴瘤[19-20]。

2 EBV感染与自身免疫性疾病的相关性

多项临床试验和动物实验研究显示，EBV潜伏期感染与自身免疫性疾病相关。在EBV潜伏感染期间，一方面病毒可通过上调抗凋亡基因如bcl-2抑制感染的B淋巴细胞的凋亡造成其数量的增多；另一方面通过分子模拟机制，例如模拟T淋巴细胞CD40配体，促进B淋巴细胞的活化。因此B淋巴细胞数量增多与活化促进了自身免疫反应的发生。研究显示，年轻SLE患者中EBV感染率为99%，而同年龄段健康对照组为70%[21]；RA患者外周血中EBV阳性的B淋巴细胞数量同样高于正常人群[4]。动物实验研究发现，小鼠体内LMP1、LMP2A、EA、MA的过表达能够促进B淋巴细胞生成SLE相关自身抗体，其表达水平可能成为SLE诊断以及评估病情严重程度的潜在的生物标志物[22]。EBV与MS相关性较强，MS患者几乎100%有EBV潜伏期感染的血清学证据，即在患者血清中同时出现了VCA-IgM以及EBNA1 IgG抗体[23]，儿童期感染EBV的个体与未感染者相比患MS的概率高15倍左右[24]。此外，EBV感染导致的上皮细胞损伤及其对固有免疫与适应性免疫的刺激均可以诱发SS的发生[25]。

感染个体针对EBV转录产物产生的抗体可与其自身抗原产生交叉反应，即抗EBV相关抗体与个体自身抗原之间具有相同的抗原决定簇。如抗EBNA1抗体与自身双链DNA(dsDNA)及异质性核糖核蛋白(hnRNPL)之间便产生交叉反应，抗EBNA1抗体与dsDNA产生的交叉反应在小鼠体内能够通过共同表位以及表位扩展诱导小鼠产生抗dsDNA抗体[26]；MS患者的脑脊液中存在的抗EBNA1抗体与患者自身hnRNPL产生的交叉反应通过类似的机制促进了抗hnRNPL自身抗体的产生[27]。

3 LMP1基因与LMP1蛋白在EBV感染中的主要功能

LMP1基因是关键的致瘤基因，表达于Ⅱ、Ⅲ型EBV潜伏性感染过程中，对于EBV致瘤、EBV潜伏感染状态的维持以及EBV在体外转化原代B淋巴细胞为永生化淋巴母细胞过程中起重要作用。LMP1是由LMP1基因编码的表达于EBV感染细胞膜表面的一种蛋白，其完整结构包括由162个氨基酸组成的6个疏水跨膜区域，由23个氨基酸组成的N端和由200个氨基酸组成的C端[28-29]。LMP1并不需要配体的结合和激活，其C末端的两个结构域——CTAR1和CTAR2可分别与肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)和肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域(TRADDD)蛋白分子结合而激活核因子κB(NF-κB)，继而刺激B淋巴细胞免疫球蛋白基因的表达[30]，此作用与辅助性T细胞(Th细胞)CD40配体通过CD40介导的作用相似，使B淋巴细胞处于类似被Th细胞辅助的活化状态，NF-κB的激活还下调了Toll样受体9(TLR9)的表达，这有助于维持EBV的潜伏感染状态[31]。LMP1导致的NF-κB通路活化是其致病性的重要原因，尽管生理性NF-κB通路的活化对淋巴细胞至关重要，但过度活跃的NF-κB信号传导能够促使炎症性疾病与癌变的发生[32]。另外，LMP1也影响丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-K)、干扰素调节因子7(IRF7)以及STAT等多种细胞通路。例如LMP1可以通过PI3K/AKT/FOXO3a信号通路调控人miR-21导致鼻咽癌的发生[33]，通过激活MAPK通路影响细胞侵袭和转移等。

4 LMP1细胞调控功能与自身免疫性疾病的关系

4.1 LMP1对淋巴细胞活化因子(BAFF)生成的促进作用

BAFF又称B淋巴细胞刺激物(BLyS),主要由单核细胞、树突状细胞及T细胞产生，属于肿瘤坏死因子(TNF)家族，在人体内具有刺激B淋巴细胞增殖与诱导免疫球蛋白生成的作用[34],在SLE、IgA肾病、SS和RA患者的血清中BAFF水平较正常人群升高[35]。且有研究表明，一些自身免疫性疾病患者血清中BAFF升高水平与疾病的严重程度及致病性自身抗体的水平呈正相关[34,36]。

LMP1促BAFF生成的机制已被多项研究证实。CD4+T细胞表面CD40配体与树突状细胞表面CD40结合后可上调树突状细胞BAFF表达，由于表达于EBV主要靶细胞——B淋巴细胞表面的LMP1可以模拟CD4+T细胞表面的CD40配体，因此其通过模仿CD40信号传导起到上调B淋巴细胞BAFF表达的作用[7]。BAFF基因启动点至少含有6个NF-κB结合位点，NF-κB的非经典激活途径对于上调BAFF蛋白表达至关重要[37]，LMP1 C末端的CTAR1与CTAR2结构域可与TRAF结合而激活NF-κB，实验表明，LMP1可通过CTAR结构域以及TRAF上调BAFF表达[7,38]。

4.2 LMP1对B淋巴细胞表面标志物CD23表达的影响

CD23是B淋巴细胞和单核细胞表面的一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，属于C型动物凝集素超家族，为B淋巴细胞活化的标志。CD23脱落可以形成可溶性CD23(sCD23)，是一种自分泌的B淋巴细胞生长因子(BCEF),可与CD21结合激活磷脂肌醇信号途径(PKC)，导致B淋巴细胞的增殖。因此，CD23加重风湿病的机制可能是其促进B淋巴细胞的分化成熟而阻止其凋亡，使之呈现高反应性，进而合成和分泌自身抗体，加重自身免疫性反应。在SS、SLE患者组血清中sCD23均较正常人群高，活动期SLE患者经过有效治疗后外周血sCD23表达可降低[39]。体外实验证明，电穿孔法转染LMP1重组质粒可使人B淋巴瘤细胞株Lockes和BJAB的CD23表达量升高[8]。另一项研究发现，SS患者病理损害重的唇腺组织LMP1阳性表达程度较强，其中，CD23阳性表达部位多在呈灶状浸润的淋巴细胞区域，腺泡以及导管周围浸润的淋巴细胞上也可见阳性表达，LMP1在唇腺组织中主要表达于腺泡上皮细胞及小导管上皮细胞中，部分位于浸润的淋巴细胞中，而CD23的表达程度与LMP1呈正相关[40]。

4.3 LMP1基因及LMP1蛋白与IFN的关系

IFN是一类可以抑制病毒感染、调节免疫功能的细胞因子，通过诱导细胞表达多种蛋白质而发挥生物学功能，编码这些功能蛋白质的基因称作干扰素刺激基因(ISGs)，约有10余种。SLE和其他自身免疫性疾病患者中有IFN水平增高的现象，IFN在这些疾病发展过程中具有多种作用，如在SLE模型小鼠和SLE人群中，过量的IFNα能够减少NO生成，造成血管内皮功能障碍[41]。以往研究还发现，SLE病人外周血淋巴细胞中LMP1基因mRNA表达较正常人明显升高，并且与OASL、ISG15、LY6E等ISGs的表达呈显著正相关[42]。IRF是一类能够对IFN基因表达进行调控的多功能转录因子，共有9个成员，IRF7是诱导IFN产生的重要调节因子，IRF7的降解能够阻断IFNα和IFNβ的表达[43]，SLE患者IRF7基因mRNA水平较正常人高，且与IFN水平及系统性红斑狼疮疾病活动度(SLEDAI)积分呈正相关，SLEDAI积分是反应SLE疾病活动程度的指标，因此可以认为IRF7基因表达异常影响着SLE的发病及其病情进展[44]。体外实验证实LMP1可以诱导EBV潜伏性感染的B淋巴细胞产生Ⅰ型IFN，其作用机理是LMP1具备活化和募集转录因子IRF7的作用，同时，IRF7也可以被LMP1激活，共同促进IFN的产生。由于IFN的抗病毒特性有助于EBV建立或者维持潜伏期状态，因此LMP1这种促IFN产生的效应属于维持EBV潜伏性感染的机制之一[45]。尽管SLE中引起过量Ⅰ型IFN的首要原因是免疫复合物的形成，且产生Ⅰ型IFN的主要细胞是树突状细胞[46]，但LMP1作为一种影响因子，可能通过参与激活IRF7以及其本身的类IRF7作用促进IFN的产生，继而造成IFN下游ISGs表达增强，参与SLE的发生与进展。

4.4 LMP1与CD4+T细胞CD40配体的关系

CD40是与T淋巴细胞和B淋巴细胞功能均有关的一种表面抗原，可表达于B淋巴细胞、单核/巨噬细胞、树突状细胞、胸腺上皮细胞等多种细胞表面，CD40配体是一种表达于CD4+T细胞表面的活性蛋白，CD40信号具有活化PI3K等细胞通路与上调bcl家族表达的作用。LMP1可模拟CD4+T细胞的共刺激分子CD40配体从而与CD40分子竞争性结合TNF等因子，产生上调抗凋亡基因bcl-2而抑制促凋亡基因bax的作用，促进了B淋巴细胞的转化与增殖[47]。因此，LMP1使EBV感染的B淋巴细胞抗凋亡能力增强，当与CD4+T细胞随血液循环至全身器官时，后者可通过接受感染的B淋巴细胞产生的共刺激生存信号致细胞凋亡减少，产生多种细胞因子趋化炎症细胞，进而导致机体器官的损害[48]。

4.5 LMP1干预与自身免疫病的关系

目前针对LMP1治疗自身免疫性疾病的方法较少。已发现风湿性疾病常用药——雷公藤内酯醇能够降低EBV阳性的B淋巴细胞存活率，其作用机制有可能是通过抑制LMP1的ED-L1启动子，下调EBV阳性B淋巴细胞中的LMP1的表达以及转录水平[49]。

LMP1在EBV感染过程中介导的信号网络非常复杂，其多重生物学功能是多通路相互协同与影响的结果。深入了解LMP1在EBV感染过程中发生的作用，有助于了解EBV相关自身免疫性疾病的发病机制，也有助于研究如何通过干预LMP1来治疗EBV感染相关疾病。