卵母细胞衰老的分子病因学研究进展

李岩，刘珏，刘民*

(1.北京大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系，北京 100191；2.首都医科大学附属北京安贞医院-北京市心肺血管疾病研究所流行病研究室，北京 100029)

女性生殖系统对女性健康的意义重大，它是女性第一个衰老的器官系统，比其他一般器官的自然功能老化早大约十年[1]。随着全球预期寿命的增加，生殖衰老正在成为一个重要的健康问题。了解卵母细胞衰老的原因和分子机制对于抑制与年龄相关的疾病和促进女性健康长寿是至关重要的。人类的卵母细胞数量逐渐减少、卵母细胞质量逐渐变差是导致女性生殖衰老的一个重要因素[1]。本文将从基因组的完整性和稳定性、线粒体功能障碍、端粒缩短、DNA损伤修复、表观遗传学改变、以及神经内分泌级联反应这几个方面与卵母细胞衰老的关系，对卵母细胞衰老的分子病因学研究进展进行综述。

一、卵母细胞基因组的不完整性和不稳定性导致卵母细胞衰老

卵母细胞与体细胞一样会受到内源性和外源性因素引起的各种不同类型的DNA损伤，细胞修复DNA损伤的能力对维持其基因组完整性及正常功能至关重要。在所有DNA损伤中，DNA双链断裂因能显著改变基因的完整性而最为有害。DNA双链断裂是检测人卵母细胞老化的可靠方法，共济失调性毛细血管扩张突变(ATM)介导的DNA双链断裂是导致人卵母细胞老化的原因[2]，乳腺癌1型和2型易感蛋白(BRCA1和BRCA2)是ATM介导的DNA损伤信号通路的重要成员，对DNA双链断裂修复至关重要[3]。研究显示，BRCA基因突变的女性卵巢储备减少、卵巢老化加速、具有过早自然绝经的倾向[4]。BRCA1与RAD51协同作用，激活RAD51介导的DNA双链断裂的同源重组修复，并且BRCA1参与细胞周期调控，是细胞周期检查点蛋白激酶2(CHK2)调节有丝分裂进程的靶点[5]。BRCA1基因突变、p53依赖的细胞周期检查点停止，有丝分裂停滞导致基因组不稳定性[6]。如果敲除参与DNA双链断裂修复的主要基因(BRCA1、RAD51、ATM)，卵母细胞的数量和存活率显著降低[2]。

有研究发现，纺锤体装配检查点可以监测姐妹染色单体附着在微管上进行有丝分裂的过程。如果监测失败会导致染色体数目出现非整倍体异常，mad2和bub1是检查点调节通路的组成部分，其表达减少会增加老年妇女卵母细胞的非整倍体发生率，导致基因组的不稳定性[7]。也有研究发现，有丝分裂着丝粒相关蛋白(MCAK，一种微管解聚酶)及调节其精确定位和活性的极光激酶B(AURKB)表达减少和定位错误会导致卵母细胞染色体分离错误，非整倍体发生率增加[8]。此外，p53家族成员(p53/p63/p73)是细胞周期、凋亡和基因组稳定性的调节因子，通过监测人卵母细胞转录组的差异表达，发现p73的表达水平在老年女性中减弱[9]。这些证据表明，导致卵母细胞基因组的不完整性和不稳定性的原因是复杂的，不能归结于单一的干扰和机制，需要几个DNA修复机制的相互作用，以保护并调控卵母细胞基因组的完整性和稳定性。

二、卵母细胞线粒体功能障碍导致卵母细胞衰老

线粒体被认为是细胞的能量工厂，卵母细胞含有大量线粒体，线粒体是卵母细胞成熟、受精和胚胎发育的关键[10]。线粒体在有氧代谢产生能量的同时也会产生活性氧(ROS)，由于线粒体DNA(mtDNA)位于线粒体内膜电子传递链附近，没有组蛋白保护、抗氧化能力和DNA修复能力均较低，因此接触ROS的mtDNA很容易受到损伤，在氧化应激状态下，mtDNA的拷贝数可能增加或减少，从而影响线粒体基因组的完整性和稳定性[11]。对人卵母细胞和颗粒细胞mtDNA的研究发现，老年女性卵母细胞和颗粒细胞中正常线粒体水平显著降低[12]。

线粒体功能异常不仅直接影响卵母细胞，还与卵母细胞周围的体细胞有关。卵丘细胞控制线粒体的生物发生过程，在卵母细胞内形成足够的线粒体池，可在卵母细胞成熟的最后阶段向卵母细胞提供营养[13]。卵巢老化表现为卵巢储备下降，影响卵丘细胞控制线粒体的生物发生，线粒体功能障碍可能是卵母细胞质量受损的原因[14]。颗粒细胞和卵丘细胞中存在一种线粒体生物发生的调节因子sirtuin3，可调节其靶点谷氨酸脱氢酶的活性，进而调节线粒体的生物发生过程。研究发现，在卵巢储备减少的女性的颗粒细胞中和年龄大于40岁的女性的卵丘细胞中sirtuin3的表达减少[15]。尽管mtDNA突变的总体水平较低，但线粒体功能障碍可以加速卵母细胞的衰老，对衰老过程有着重要的影响。

三、端粒缩短引起卵母细胞衰老

端粒是线性真核染色体末端的一种特殊功能复合体，覆盖并保护染色体末端，防止末端发生DNA损伤反应[16]。端粒缩短是人类细胞老化的标志[17]，端粒酶是一种RNA依赖性DNA聚合酶，可以恢复缩短的端粒[16]。端粒磨损在卵母细胞老化过程中起着重要作用。研究发现人成熟卵母细胞的端粒长度明显短于未成熟卵母细胞，由于未受精卵母细胞中没有端粒酶活性，因此人成熟卵母细胞端粒较短的原因可能是卵发生过程中进行性端粒缩短[18]。由于端粒是具有高G-C含量的重复DNA序列，因此端粒对ROS高度敏感，即使是在卵母细胞这类非分化细胞中，氧化应激也可以导致卵母细胞端粒缩短[19]。研究显示极短端粒可以触发p53依赖性细胞周期停滞导致DNA损伤，激活细胞衰老途径[20]。通过研究原发性卵巢功能不全的女性颗粒细胞的端粒酶活性较低、端粒较短，说明端粒酶活性和端粒长度可以作为卵巢功能不全的分子标记物[21]。基于这些证据可知，卵母细胞的正常衰老伴随着端粒磨损，病理性端粒缩短会加速卵母细胞的老化，但有关激活端粒酶能否逆转卵母细胞衰老的证据尚不充分。

四、p53介导的卵母细胞凋亡

p53蛋白是一种转录因子，在DNA损伤后的修复过程中起关键的调节作用，p53被激活后调控关键过程包括DNA修复、细胞周期停滞、衰老和凋亡[22]。p53通过激活p21的转录，引起DNA损伤后细胞周期停滞，并且通过激活下游靶基因来调节细胞自噬和凋亡[22]。许多研究未能在卵母细胞中检测到p53，但p53同系物p63[23]的一种亚型tap63α在未成熟的卵母细胞核中被检测到高水平表达[24]。DNA损伤诱导p63磷酸化并导致其与p53同源的DNA位点结合，这与卵母细胞死亡有关[24]。TAP63α代表对未成熟卵母细胞DNA损伤的特异性应答，其对于监测女性生殖系的完整性至关重要[25]。

五、卵母细胞衰老的表观遗传学改变

表观遗传通过改变染色体构象而不是改变DNA序列来调节基因表达，并充当连接内外信号桥梁的作用[26]。最常见的表观遗传修饰包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA，这些表观遗传变化在调节卵母细胞衰老过程中发挥特殊的作用[27]。尽管如此，由于研究所涉及的细胞类型的敏感性，许多与卵母细胞衰老有关的表观遗传学研究多是在小鼠卵母细胞上进行，对人类卵母细胞老化的表观遗传学我们却知之甚少。

1.DAN甲基化：DNA甲基化是最具特征的表观遗传修饰，涉及转录抑制、X染色体失活以及基因组印记。它是在DNA甲基化转移酶(dnmts)的作用下，基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5′碳位共价键结合一个甲基基团，富含CpG的区域，称为CpG岛[28]。有研究显示，p53家族的三个成员(p53/p63/p73)在卵母细胞衰老过程中具有潜在作用，其中p73基因编码两种主要的蛋白质亚型(TAp73和ΔNp73)。在人类中，受DNA甲基化模式调节的TAp73在38岁以上女性的卵母细胞中的表达明显低于36岁以下女性的卵母细胞[9]。但目前还没有直接的证据证明人类卵母细胞中的DNA甲基化状态受到老化的影响。

另外，DNA甲基化也可以发生在CpG之外，被称为非CpG甲基化或不对称甲基化。近期有研究采用单细胞全基因组亚硫酸氢盐测序技术发现，非CpG甲基化在人卵母细胞DNA中尤其丰富，随着卵母细胞的成熟，基因组中的非CpG甲基化逐渐积累，但非CpG甲基化在特定细胞类型中发挥的生物学作用仍有待研究，未来对与人卵母细胞成熟相关的单细胞转录组学变化的研究将有助于阐明非CpG甲基化在人卵母细胞成熟过程中所起的生理作用[29]。

2.组蛋白修饰：尽管DNA甲基化是最容易理解的表观遗传标记，但它与其他表观遗传标记之间存在关联，如组蛋白修饰[30]。组蛋白修饰，包括甲基化、乙酰化、泛素化和其他修饰，是另一个重要的表观遗传修饰。研究表明，年龄的增加不仅改变人卵母细胞的甲基化模式，也改变人卵母细胞的组蛋白乙酰化。组蛋白4不同溶血素(h4k5、h4k8、h4k12和h4k16)的乙酰化在细胞分裂生发泡(GV)阶段的人卵母细胞中强烈表达，而在MⅠ和MⅡ阶段的人卵母细胞中四种组蛋白4赖氨酸的去乙酰化比例不同[31]。这项研究还表明，卵母细胞减数分裂过程中有缺陷的组蛋白去乙酰化随着年龄的增长而增加，在高龄妇女的卵母细胞中观察到h4k12乙酰化增加，高龄对女性MⅡ期卵母细胞中h4k12去乙酰化有负面影响[31]。

此外，组蛋白泛素化也受到人卵母细胞老化的影响，随着年龄的增长，组蛋白泛素化减少。通过比较37～39岁妇女与小于36岁妇女在细胞分裂中期(MⅡ)卵母细胞的mRNA表达谱，发现细胞周期、蛋白质泛素化等生物学过程与卵母细胞衰老相关[32]。对于37～39岁的女性，卵母细胞中的泛素1(一种泛素样蛋白)的基因下调，但泛素特异性肽酶USP2、USP34和USP42的三个基因上调[32]。这表明，人类卵母细胞的衰老可能影响泛素化。有研究表明老年女性颗粒细胞低氧会产生ROS，引起氧化应激，诱导颗粒细胞和卵母细胞自噬，低氧是卵巢衰老和卵母细胞质量下降的主要原因[33]。缺氧导致介导DNA损伤信号通路的BRCA1蛋白启动子的H3K4甲基化降低，H3K9甲基化增加，同时H3K9乙酰化降低[34]。这些结果也为卵母细胞衰老相关的表观遗传改变提供了证据。

3.非编码RNA：除了DNA甲基化和组蛋白修饰，基于非编码RNA(如microRNA)的表观遗传修饰也是重要的表观遗传机制。小的非编码RNA分子称为microRNA，通过序列特异性相互作用与靶mRNA特异性结合，抑制翻译或降解靶mRNA，在转录后水平调节蛋白质翻译[35]。

在人类MⅡ期卵母细胞和周围的卵丘细胞中发现含有丰富的microRNA，它们可能在调节卵母细胞和卵丘细胞之间相互关系中发挥作用[36]。对女性MⅡ期卵母细胞中表达的microRNA的研究，发现12个microRNA参与人卵母细胞老化过程的调节，其中3个microRNA(let-7b-5p、miR-19a-3p和miR-519d-3p)表达水平下调，9个microRNA(let-7e-5p、miR-29a-3p、miR-126-3p、miR-136-5p、miR-192-5p、miR-203a-3p、miR-371-3p、miR-484和miR-494-3p)表达水平上调[37]。随着女性年龄的增长，卵巢储备减少，这与microRNA及其他非编码RNA相关，卵母细胞质量随年龄的变化可能受microRNA及其他非编码RNA调节[38]。在年龄大于38岁的妇女的卵泡液中的microRNA的表达谱与年龄小于31岁的妇女明显不同，4种microRNA的表达存在差异，其中一些microRNA的预测靶点明显富含参与硫酸肝素生物合成、细胞外基质受体相互作用、碳水化合物消化吸收、p53信号传导和细胞因子-受体相互作用的基因，其中一些途径已被报道是女性生殖衰老的决定因素[39]。此外，多囊卵巢综合征或卵巢早衰患者的卵泡液中的microRNA表达谱与正常人的卵泡液中的microRNA表达谱不同[40]。早发性卵巢功能不全(POI)是女性生殖衰老的一种极端表型[41]，有研究利用microRNA和mRNA微阵列芯片检测POI患者颗粒细胞中的分子标志物，发现miR-379-5p明显上调，其通过直接靶向PARP1和XRCC6抑制细胞增殖并损害DNA修复功能，证实DNA修复途径对POI的意义，并提出该病的表观遗传学解释[42]。

六、神经内分泌级联反应介导的女性卵巢衰老

人体营养轴由垂体前叶产生的生长激素(GH)及生长介质胰岛素样生长因子(IGF-I)组成，IGF-I是细胞对GH的反应继发产生的。IGF-I的细胞内信号通路与胰岛素诱导的信号通路相同，因此被称为“胰岛素和IGF-I信号传导通路”，是进化过程中最保守的衰老控制通路[43]。在人类卵巢中，IGF-II主要由颗粒细胞产生，而IGF-I则在卵泡膜细胞表达[44]。卵泡膜细胞是女性产生维持卵泡生长的激素的关键，卵泡膜细胞产生雄激素，颗粒细胞将雄激素转化为雌激素，随后颗粒细胞源性雌激素又反馈调节卵泡膜细胞[45]。随着女性年龄的增长，雄激素产生的减少会导致老化卵巢窦状卵泡对促卵泡激素(FSH)的反应降低，并且具有IGF-I介导或增强的作用[46]。

七、总结与展望

综上所述，卵母细胞衰老的分子机制非常复杂，由于人卵母细胞作为研究材料获取的限制，卵母细胞老化的分子病因学研究的直接证据仍是有限的。尽管如此，目前的发现对我们从分子层面理解卵母细胞衰老的规律提供了一些关键的提示性线索：首先，越来越多的证据表明端粒和端粒长度与人类生殖衰老密切相关，关注端粒长度作为卵母细胞衰老的标志，研究其在多囊卵巢综合征、卵巢早衰和子宫内膜异位症中的作用，使得端粒生物学正在成为女性生殖衰老领域的一个重要课题。其次，深入了解卵母细胞的基因组结构、对DNA损伤的易感性和DNA修复机制的差异对研究卵母细胞衰老的规律也是至关重要的。最后，microRNA及其靶点也在卵母细胞衰老相关疾病中发挥重要作用，可为疾病的诊断和治疗提供新的策略。