转OsALS基因浮萍的抗除草剂活性分析

冯国栋 刘 菲 胡建立 张融雪 孙 玥 朱晔荣 王 勇 苏京平 刘学军

摘    要：以乙酰乳酸合成酶为靶标的除草剂具有用量少、选择性强、杀草谱广等特点，在田间被广泛应用。本研究前期筛选到一株抗咪唑啉酮类除草剂“普施特”的水稻植株，并通过克隆获得了目的基因OsALS，序列分析发现OsALS基因的第627位点发生了突变。本研究为进一步研究突变的OsALS基因与水稻抗除草剂活性之间的关系，将OsALS构建到了pCAMBIA1301载体上，获得了转OsALS基因的浮萍并进行了转基因浮萍对除草剂的活性分析。研究结果表明，OsALS基因中627位点的突变很可能是导致转基因浮萍对除草剂“普施特”产生抗性的重要原因，研究结果为水稻种质资源和除草剂的开发提供了重要支持。

关键词：OsALS基因;浮萍;载体构建;除草剂

中图分类号：Q789         文献标识码：A          DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.01.003

Analysis of Herbicide Resistance Activity of Transgenic OsALS Duckweed

FENG Guodong1， LIU Fei2， HU Jianli1，2， ZHANG Rongxue2， SUN Yue2， ZHU Yerong1， WANG Yong1， SU Jingping2， LIU Xuejun2

（1.Nankai University， Tianjin 300071， China;2.Crop Research Institute of Tianjin Academy of Agricultural Sciences， Tianjin 300112， China）

Abstract：The herbicides targeting at acetolactate synthase are widely used in the field， because their low dosage， high selectivity and wide herbicide spectrum. In the previous study， we screened one line of rice，which has resistance to "Pursuit"， an imidazoline ketone herbicide，and cloned the OsALS gene. Analysis of sequencing found that OsALS gene had a mutation in 627 site. Here， we successfully constructed OsALS into plant expression vector pCAMBIA1301， and got OsALS transgenic duckweed. In addition， we analyzed the activity of herbicide in transgenic duckweeds. The results showed that the transgenic strains had resistance to Pursuit， probably resulted from the 627 site mutation in OsALS gene. These results provided important support for the rice germplasm creation and the exploitation of herbicides.

Key words： OsALS gene;duckweed;vector construction;herbicide

水稻是世界上重要的糧食作物之一，但杂草和杂草稻的出现严重影响了其生物学产量和经济产量，而杂草和杂草稻的防治也是非常棘手的问题[1-3]。目前，利用除草剂防治杂草和杂草稻是最佳手段。但随着除草剂的广泛使用，导致田间杂草和杂草稻的抗药性越来越强，这对田间除草工作提出了更高的要求。

乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase， ALS）在植物体中是催化支链氨基酸合成的重要催化酶[4]。以ALS为靶标的除草剂能与植物体内的ALS蛋白结合，抑制一些侧链氨基酸的合成，如缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸，从而抑制细胞的分裂，影响植物生长。咪唑啉酮类除草剂就是以ALS为靶标设计的一类除草剂，通过抑制乙酰乳酸合成酶的活性，从而抑制侧链氨基酸的合成[5]。水稻对咪唑啉酮类除草剂表现的抗性主要是某些氨基酸位点的改变，导致ALS蛋白结构改变。目前，已报道位点包括Gly 95、Ala 96、Ala 122、Pro 197、Asp 376、Trp 548、Ser 627、Ser 653 和 Gly 654，不同位点突变产生了抗除草剂水平的差异[6-10]。

浮萍（Lemna minor L.）广泛存在于世界各地，经常被作为模式植物进行植物生理学研究。此外，浮萍也是一种有效的环境监测植物。早在20世纪50年代，就有浮萍被用于检测苯氧类除草剂的报道，随后不同属种的浮萍被广泛用于除草剂的筛选和作用效果的评估[11]。如郑丽英[12]、梁卫玲等[13]、田延辉等[14]、汪传刚等[15]先后分别研究了双草醚、乙草胺、丁草胺和二甲戊灵等除草剂对浮萍的影响。

笔者在前期工作中，对合作单位天津市农作物研究所筛选到的抗咪唑啉酮类除草剂“普施特”水稻（命名为‘选一）中的ALS基因进行了克隆。通过测序显示‘选一中的ALS基因序列1880位点的G突变成了A，导致编码的氨基酸由丝氨酸变成了天冬酰胺。该突变导致“选一”水稻在实验室条件下对咪唑啉酮类除草剂“甲氧咪草烟”产生非常强的抗性，同时对两种嘧啶水杨酸类除草剂“双草醚”和“嘧啶肟草醚”、两种磺酰脲类除草剂“甲基二磺隆”和“烟嘧磺隆”都有不同程度的抗性。这些结果说明，‘选一中的ALS基因关键位点的突变与抗除草剂活性密切相关[16]。为进一步验证OsALS位点突变与“选一”水稻产生抗性之间的关系，我们将该基因在浮萍中进行了遗传转化，并开展了相关的抗性试验。

1 材料和方法

1.1 供试植物

浮萍（Lemna turionifera），取材于天津市西青区淡水湖内，脱菌后在实验室无菌环境中培养。浮萍叶状体的继代培养采用DATKO培养液，培养温度为（23±2） ℃，光照周期为16L/ 8D，光照强度为4 000 Lx。浮萍愈伤组织的培养条件为温度（19±1） ℃，光照强度和光周期与叶状体相同。

供试载体：含有“选一”水稻中克隆基因OsALS的pGEM-T载体和植物双元表达载体pCAMBIA1301，由本实验室保存。亚克隆中间载体pEXP-DR，是在pSK载体基础上改造为pEXP载体后，经过本试验进一步改造成为pEXP-DR。

1.2 主要试剂（盒）与仪器

详细见表1和表2 。

1.3 OsALS表达载体构建

首先将在水稻中克隆出的OsALS基因，构建到pEXP-DR载体上，获得pEXP-OsALS，然后通过限制性内切酶获得由35S驱动、ployA终止的OsALS基因表达盒与pCAMBIA1301表达骨架，经过酶连反应获得pCAMBIA1301-OsALS基因的双元表达载体，构建流程如图1所示，并转化到EHA105农杆菌中保存。其中大肠杆菌质粒提取参照康为世纪生物科技有限公司PurePlasmid Mini Kit说明书进行，提取的质粒于-20 ℃保存;质粒对大肠杆菌感受态细胞的转化参照大连宝生物公司DH5α使用说明书进行;土壤农杆菌感受态细胞的转化参照上海唯地生物技术有限公司EHA105 Chemically Competent Cell说明书进行。

酶切反应参照TaKaRa公司限制性内切酶的说明书进行。琼脂糖凝胶电泳回收参照康为Gel Extraction Kit使用方法说明书进行。连接体系中各个组分的用量，按照TaKaRa公司T4连接酶的说明书进行。本文中涉及到其他修饰酶的反应均严格参照TaKaRa公司的说明书进行。

1.4 浮萍的遗传转化与筛选

用构建好的pCAMBIA1301-OsALS质粒侵染浮萍愈伤组织，经过再生和筛选等步骤获得转基因浮萍，并进行除草剂抗性试验。该部分试验方法参照Yang等[17]建立的浮萍遗传转化体系并由魏莹等[18]进行优化，侵染后的愈伤组织的筛选方法由武凤洁等[19]优化。

1.5 抗除草剂活性试验

用DMSO将除草剂粉末完全溶解，加水定容至最终浓度即为母液。用于浮萍筛选和鉴定的试验在6孔板中进行，总体积为10 mL，按照终浓度加入培养基和除草剂母液。通过比较浮萍生长状态和生长速率，以分析转基因浮萍的抗除草剂活性。

2 结果与分析

2.1 pCAMBIA1301-OsALS质粒构建与鉴定

为了研究OsALS基因对除草剂抗性的影响，笔者使用35S启动子驱动OsALS基因，使其过量表达，将其连入双元表达载体pCAMBIA1301中获得完整的表达盒35S：ALS：ployA，并将该双元载体导入农杆菌EHA105中。使用农杆菌介导的转化方法转化浮萍，以达到在浮萍中过表达OsALS基因的目的。

载体构建是先采用PCR扩增得到的2 000 bp左右的目的OsALS基因条带，用凝胶回收试剂盒回收该片段后，用T4连接酶与pEASY-T1 Simple vector载体相连，经PCR鉴定阳性转化子标记为pT-ALS（图2a）。

对阳性转化子pT-ALS提质粒后用BglⅡ、NdeⅠ双酶切，得到2 000 bp左右的目的基因条带。同时用BglⅡ、NdeⅠ双酶切中间载体pEXP-35S-Tp-pA获得载体骨架（图2b），经凝胶电泳切胶回收后，与胶回收的OsALS基因通过连接酶连接，得到pEXP-ALS。经PCR鉴定得到的阳性转化子标记为pEXP-ALS（图2c）。

为进一步获得植物表达载体，以限制性内切酶KpnⅠ和XbaⅠ共同对pEXP-ALS和pCAMBIA1301载体进行双酶切，将酶切后的35S-ALS-pA和pCAMBIA1301载体骨架利用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒进行回收纯化，并利用T4连接酶进行连接，转化大肠杆菌感受态细胞后，获得转化子pCAMBIA1301-35S-OsALS。通過质粒PCR和限制性内切酶Bgl II和Nde I对质粒进行双酶切鉴定，结果与预期相符，说明成功获得最终的表达载体pCAMBIA1301-35S-OsALS（图2d）。

将pCAMBIA1301-35S-OsALS质粒利用冻融法导入农杆菌EHA105中，通过对获得的转化子进行PCR 和酶切鉴定，发现目的条带的大小与预期相符，同时通过对目的片段的测序，结果显示所获EHA105-pCAMBIA 1301-ALS菌株为阳性菌株。

2.2 转OsALS基因浮萍的再生与鉴定

按照课题组建立的遗传转化方法，用EHA105-pCAMBIA 1301-ALS菌株对浮萍愈伤组织进行了侵染，经恢复和再生培养等过程，获得5个再生株系，笔者对其中4个进行了鉴定和抗性筛选。完整的再生过程如图3所示。

为获得转化株系，首先采用潮霉素（Hyg）进行了抗性筛选，使用不同浓度的Hyg对再生植株进行筛选，并用非转基因浮萍（WT）作为对照。结果显示，当浓度为1.0 mg·L-1时，WT几乎全部死亡。随着Hyg浓度升高，再生植株的生长状态越来越差，对Hyg的抗性越来越低，当Hyg浓度为2.5 mg·L-1及以上时，再生植株对Hyg几乎没有抗性。由此，笔者确定了Hyg的最佳筛选浓度为1.0～1.5 mg·L-1。经过筛选获得4株抗性株系，分别标记为ALS2、ALS3、ALS4和ALS5，抗性结果如图4所示。

2.3 转OsALS基因浮萍分子生物学鉴定

为进一步对抗性株系进行鉴定，采用了基因组PCR检测及测序验证。首先，用SDS法提取野生型株系和转基因抗性株系总基因组DNA。PCR结果显示，4个抗性株系均有目的基因条带，而WT株系未有扩增条带，结果如图5所示，并将4个株系DNA扩增产物进行测序。测序结果中，错误匹配点为克隆ALS基因中的突变位点（图6），因此初步推断OsALS基因已经插入到浮萍基因组中。

同时为了鉴定OsALS基因在浮萍中是否真正表达，又进行了RT-PCR鉴定。首先使用RNA试剂盒提取WT和4株抗性株系的RNA，然后用NanoDrop2000检测RNA质量和浓度，并进行琼脂糖凝胶电泳检测RNA是否降解。用反转录试剂盒进行反转录得到cDNA，再以cDNA为模板，进行PCR检测。PCR产物的电泳结果显示，得到的4个抗性株系的基因都有不同程度表达，由此推测4个抗性株系都为ALS的转基因株系，如下图7所示。

2.4 转OsALS基因浮萍除草剂抗性试验

2.4.1 抗除草剂“普施特”筛选及鉴定   “普施特”是咪唑啉酮类除草剂之一，实验室早期初步探索出了“普施特”抑制WT生长的大致浓度范围，因此本试验设置了0.1，0.5，1.0，2.0，4.0，10 mg·L-1共6个浓度进行筛选。每个处理最初放入3株两叶的浮萍，于16 L，23 ℃： 8D，21 ℃环境中培养，6 d后进行表型比对，并统计叶片数量及生长状态。

由图8可知，WT在普施特浓度为0.1 mg·L-1时，可以缓慢生长，生长速率明显低于4个转基因株系，而在0.5 mg·L-1及以上浓度时未见到明显扩繁现象，但即使在10.0 mg·L-1时WT株系也没有全部变白或死亡现象。随着普施特筛选浓度的增加，ALS转基因株系表现出了越来越低的抗性。ALS 2在2.0 mg·L-1范围内可以进行不同程度的扩繁，长出的叶片大多呈浅绿色。 ALS 3、ALS 4和ALS 5三个株系在4.0 mg·L-1时仍有生长。但转基因株系在普施特浓度为10.0 mg·L-1时，生长受到的影响远高于WT，另外转基因株系之间受普施特影响程度也存在差异。

2.4.2 抗除草剂“二甲戊灵”筛选及鉴定   笔者为了验证ALS基因突变位点与水稻抗药性间的关系，我们用非ALS类除草剂对转基因株系进行鉴定。设定了0.5，1.0，5.0，10.0，20.0 mg·L-1 共5个终浓度梯度进行试验，每个处理最初接入浮萍数量均为3株，12 d后拍照记录，结果如图9所示。

由图9可知，无论WT还是转基因株系，对于低浓度的二甲戊灵均有一定抗性。随着浓度增加，浮萍受“二甲戊灵”影响加剧。通过叶状体数目的比较，发现WT和转基因株系在不同浓度时无明显差异。因此我们推断转ALS基因没有改变浮萍对“二甲戊灵”的抗性。

3 结论与讨论

本研究在前期克隆抗咪唑啉酮类除草剂水稻‘选一OsALS基因的基础上，通过植物表达载体pCAMBIA1301-35S-OsALS的成功构建以及对浮萍的遗传转化，筛选获得4个OsALS转基因浮萍株系。同时，通过对转基因株系的ALS类除草剂“普施特”和非ALS类除草剂“二甲戊灵”的抗性分析，发现转基因浮萍对“普施特”有一定的抗性，而对“二甲戊灵”没有显著抗性;另外，课题组通过对OsALS基因进行定点突变，获得了突变基因OsALSC512A，实现了第171位脯氨酸残基变为组氨酸残基（Pro171His），并将该基因转化了拟南芥，突变基因OsALSC512A的过表达可以赋予转基因拟南芥一定的双草醚、甲基二磺隆和五氟磺草胺抗性， 但是不能改变拟南芥對普斯特的抗性[20]，与文献报道相似，即OsALS基因的Pro171位点的突变，可以导致对磺酰脲类除草剂的抗性，但在某些植物中还可以同时对其他的一种或多种 ALS靶标除草剂产生抗性[21-23]，进一步证明了OsALS基因中关键位点的突变和抗除草剂活性之间存在一定的相关性。也为通过基因编辑创制抗除草剂水稻种质的研究提供了数据支持。

参考文献：

[1]GOULART I C G R， MATZENBACHER F O， Jr A M. Differential germination pattern of rice cultivars resistant to imidazolinone herbicides carrying different acetolactate synthase gene mutations[J]. Weed research， 2012， 52（3）：224-232.

[2]温广月， 沈国辉， 钱振官， 等. 杂草稻对水稻生长及产量的影响[J]. 杂草学报， 2011， 29（2）：51-53.

[3]刘兴林， 孙涛， 付声姣， 等. 水稻田除草剂的应用及杂草抗药性现状[J]. 西北农林科技大学学报（自然科学版）， 2015， 43（7）： 115-126.

[4]WEBSTER E P， MASSON J A. Acetolactate synthase-inhibiting herbicides on imidazolinone-tolerant rice[J]. Weed science， 2001， 49（5）： 652-657.

[5]GASTON S， ZABALZA A， GONZALEZ E M， et al. Imazethapyr， an inhibitor of the branched-chain amino acid biosynthesis， induces aerobic fermentation in pea plants[J]. Physiologia plantarum， 2010， 114（4）： 524-532.

[6]HAN H， YU Q， PURBA E， et al. A novel amino acid substitution Ala-122-Tyr in ALS confers high-level and broad resistance across ALS-inhibiting herbicides[J]. Pest management science， 2012， 68（8）： 7.

[7]ENDO M， OSAKABE K， ONO K， et al. Molecular breeding of a novel herbicide-tolerant rice by gene targeting[J]. The Plant journal， 2007， 52（1）： 10.

[8]POWLES S B， YU Q. Evolution in Action： Plants Resistant to Herbicides[J]. Annual review of plant biology， 2010， 61（1）： 317-347.

[9]RAJGURU S N， BURGOS N R， SHIVRAIN V K， et al. Mutations in the red rice ALS gene associated with resistance to imazethapyr[J]. Weed science， 2005， 53（5）： 567-577.

[10]張微， 王良群， 刘勇，等. 高粱遗传转化研究进展[J]. 安徽农业科学， 2015， 43（27）： 387-389，392.

[11]朱晔荣， 马荣， 刘清岱，等. 浮萍相关研究的几方面重要进展[J]. 生物学通报， 2010， 45（4）： 4-6.

[12]郑丽英. 双草醚和Cu对浮萍的毒性效应[J]. 广州化工， 2012， 40（19）： 54-55.

[13]梁卫玲， 唐美珍， 王艳娜. 乙草胺、丁草胺及其复合污染对浮萍的毒性效应研究[J]. 绿色科技， 2012（11）： 130-133.

[14]田延辉， 姜辉， 黄继光， 等. 两种除草剂对紫背浮萍的生长抑制活性研究[J]. 农药科学与管理， 2015， 36（3）： 61-65.

[15]汪传刚， 龚道新， 施翔， 等. 噻吩磺隆对三叶浮萍生长的影响[J]. 农药科学与管理， 2007， 28（1）： 24-27.

[16]李燕燕， 刘菲， 张红磊， 等. 水稻对几种除草剂的抗性及其相关性基因的克隆[J]. 南开大学学报， 2019， 52（1）： 44-49.

[17]YANG L， HAN J， ZUO Z J， et al. Enhanced plant regeneration in lemna minor by amino acid[J]. Pakistan journal of botany， 2014， 46（3）： 939-943.

[18]魏莹， 李红雅， 王勇，等. L-半胱氨酸、L-色氨酸和L-天冬氨酸对浮萍愈伤组织再生影响的探索[J]. 兰州大学学报（自然科学版）， 2018， 54（2）： 267-271.

[19]武凤洁， 朱晔荣， 姬晓櫞， 等. 浮萍遗传转化体系的建立和优化[J]. 生物学通报， 2017 （1）： 53-55.

[20]辛洁，胡健立，张红磊，等. 过表达OsALS C512A基因拟南芥对几种除草剂抗性的研究[J]. 南开大学学报，2019，52（4）：15-22.

[21]DUGGLEBY R G， McCOURT J A， GUDDAT L W. Structure and mechanism of inhibition of plant acetohydroxyacid synthase[J]. Plant physiol biochem， 2008， 46： 309-324.

[22]YU Q， POWLES S B. Resistance to AHAS inhibitor herbicides： current understanding[J]. Pest manag sci， 2014， 70： 1340-1350.

[23]FARTYAL D， AGARWAL A， JAMES D， et al. Developing dual herbicide tolerant transgenic rice plants for sustainable weed management[J]. Sci rep， 2018， 8： 11598-11562.

收稿日期：2019-10-29

基金项目：国家重点研发计划子课题（2017YFD01005050103）;天津市2018年现代农业产业技术体系创新团队建设（ITTRRS2018003）

作者简介：冯国栋（1993—），男，河北黄骅人，在读硕士生，主要从事植物生理技术方面的研究。

通讯作者简介：朱晔荣（1973—），女，内蒙古人，副教授，博士，主要从事生物技术方面的研究。