血清、脑脊液中S-100B、NSE水平与缺血性脑卒中的研究*

2020-02-14牛莉莉闫文萍马红萍李建明

国际检验医学杂志 2020年3期

牛莉莉，闫文萍，马红萍，李建明△

(1.新疆昌吉州人民医院检验科，新疆昌吉 831100；2.新疆维吾尔自治区儿童医院检验科，新疆乌鲁木齐 830000)

缺血性脑卒中又称脑梗死，是指因脑部血液供应障碍，缺血、缺氧所导致的局限性脑组织的缺血性坏死或软化。缺血性脑卒中的临床常见类型有脑血栓的形成、腔隙性梗死和脑栓塞等，缺血性脑卒中占脑卒中的80%[1]。临床表现以猝然昏倒、不省人事、半身不遂、言语障碍、智力障碍为主要特征，缺血性脑卒中不仅给人类健康和生命造成极大威胁，而且给患者、家庭及社会带来极大的痛苦和沉重的负担。目前，S-100B蛋白及神经元特异性烯醇化酶(NSE)在脑组织中水平较高[2-3]，成为脑损伤的新一代生化标志物[4]。

由于S-100B蛋白及NSE存在于脑组织中，在脑卒中过程中，其首先出现在脑脊液中，经过破坏的血脑屏障才能溢出出现在血液中，为了探讨缺血性脑卒中患者S-100B蛋白及NSE不同时间在脑脊液及血液中的梯度变化，本研究使用大脑中动脉闭塞缺血模型(MCAO)线栓法对SD大鼠造模[5]，模型评价完毕后检测其脑脊液及血清中S-100B蛋白及NSE的水平，以提供在缺血性脑卒中患者不同时间段脑脊液及血液的变化趋势、损伤程度及与梗死体积、神经功能学评价的相关性。现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料实验动物：无特定病原体(SPF)级SD雄性大鼠48只，体质量(180～200 g/只)购自中国新疆医科大学实验动物中心(SYXK新2011-0003)。

1.2试剂与仪器麻醉剂、10%水合氯醛(分析纯)均购自中国上海山浦化工有限公司，0.35 mL/100 g，对于未完全麻醉的动物每次加量0.1～0.2 mL，延长观察时间，切不可急躁导致用量过大引起SD大鼠死亡。手术器械购自中国上海医疗器械公司；碘伏消毒液购自中国北京三河制药厂；HHS-28电热恒温水浴箱购自中国上海东星建材实验设备有限公司；非吸收性外科缝线(型号1#、4#)、线栓购自中国平顶山豫顺生物科技有限公司，根据实验需要选择型号3043-100，线身直径0.28 mm，硅胶直径(0.43～0.02)mm，线栓总长50 mm；脑组织染色使用2% 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)，货号G3005；NSE、S-100B检测试剂盒均购自中国上海罗氏诊断公司，货号分别为12133113122、03175243190；脑脊液抽取采用大鼠脑立体定向仪[6]。

1.3方法

1.3.1实验SD大鼠饲养方法及分组所有SD大鼠均饲养在SPF级动物房内，室温(25～2)℃，给予SPF鼠料及SPF玉米芯垫料，两天更换一次饲养盒。将48只SD大鼠随机编号分为8组，每组6只，手术后8 h做行为学评价，按照不同时间段术后8 h、12 h、1 d、3 d、5 d、7 d及21 d腹腔取血及抽取脑脊液。

1.3.2MCAO操作步骤采用经过探索和改良的颈总插入法在颈部皮肤备皮，灭菌和充分暴露颈部后取正中横向切口。钝性分离肌肉，暴露右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，沿着颈总动脉和迷走神经结扎、切断颈外动脉分支，结扎/不结扎翼鄂动脉，结扎颈总动脉并从颈总动脉动脉插入线栓，沿颈外动脉、颈总动脉连接部和颈内动脉缓慢前进，至颈内动脉颅内连接部时即可阻断大脑中动脉的血流[7]。

1.3.3动物行为学评分按照大鼠神经功能缺损的详细评分标准[8]对所有大鼠进行动物学行为评定，标准如下：(1)0分：无神经损伤症状；(2)1分：不能完全伸展对侧前爪；(3)2分：向瘫痪侧转圈；(4)3分：向对侧倾倒；(5)4分：不能自发行走，意思丧失。

1.3.4动物脑梗死体积测量参考ASHWAL[9]等的方法，并加以改进。端头将SD大鼠脑组织完整的取出，在距额叶前端3 mm和9 mm处进行冠状切片，取中间6 mm厚的脑组织块，然后沿此脑块矢状缝两侧约2 mm处，从上至下切去两侧半球的正中结构(此结构由大脑前动脉供血，弃去)。余下的左右两侧脑块，各沿矢状切面旁开2 mm处，并和矢状切面呈30°斜切，其中外侧皮层为缺血核心区，内侧皮层为缺血半暗区。经过TTC染色后，使用ImageJ的图像处理软件，计算公式为：梗死体积=(Σ梗死区×厚度)/(Σ整个区域×厚度)×100[10]。

2 结果

2.1SD大鼠组间不同时间段S-100B蛋白及NSE血清及脑脊液中水平表达脑脊液中S-100B蛋白及NSE水平显著高于对照组及血清中水平，S-100B蛋白及NSE出现时间脑脊液早于血清；S-100B蛋白及NSE从术后8 h开始升高，S-100B蛋白在血清中3 d达到高峰，在脑脊液中1 d即可到达峰值；NSE在血清中3 d达到峰值，在脑脊液中12 h已经到达峰值；术后5 d血清及脑脊液中S-100B蛋白及NSE水平明显下降，7～12 d后与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1、图1。

2.2NSE、S-100B水平与梗死体积及神经功能评分相关性分析脑脊液、血清中NSE、S-100B水平与脑梗死体积、神经功能评分均呈正相关(P<0.05)，并且脑脊液中NSE、S-100B水平相关性均高于血清中NSE及S100B水平相关性。见表2。

表1 SD大鼠组间不同时间各检测指标水平[M(P25～P75)]

续表1 SD大鼠组间不同时间各检测指标水平[M(P25～P75)]

注：与对照组比较，*P<0.05。

图1血清及脑脊液中S-100B蛋白及NSE随时间变化趋势图

表2 NSE及S100B与梗死体积及神经功能评分相关性分析

表3 不同等级评分下各项目水平水平[M(P25～P75)]

表4 不同梗死体积下各指标比较[M(P25～P75)]

注：-表示此项无数据。

2.3不同等级评分下各指标比较随着神经功能评分增高，血清及脑脊液中NSE、S-100B水平也随之增高，梗死体积也不断增加，见表3。

2.4不同梗死体积下各指标比较随着梗死体积的增加，血清及脑脊液中NSE、S-100B水平也增高，特别是脑脊液中NSE、S-100B水平增高幅度更大，见表4。

3 讨论

S-100B蛋白是神经组织蛋白的一种全新蛋白质片段[11]，MOORE等[12]于1965年用色谱和电泳的方法首先在牛脑组织提取物中发现。S-100B蛋白在脑组织中表达水平丰富(3 500 ng/mg)，存在于中枢神经系统的神经胶质细胞、星形细胞、少突胶质细胞、大胶质细胞、小胶质细胞以及垂体前叶细胞中[13]。研究表明，影响S-100B蛋白水平的原因有3种：(1)脑损伤的严重程度及范围；(2)巨噬细胞或/和蛋白酶引起的降解作用[14]；(3)血脑屏障的破坏力度。WAINWRIGHT等[15]在2004年完成了首次人体试验，证实S-100B蛋白过量表达与急性脑损伤有直接关系，S-100B蛋白过量表达将增加大脑对缺血缺氧损伤的易感性，导致神经元凋亡。

神经元特异性烯醇化酶(NSE)是神经元和神经内分泌细胞所特有的一种酸性蛋白酶[16]。NSE在脑组织细胞的活性最高，非神经组织中活性较低。目前，考虑脑损伤引起NSE水平升高的机理是：脑损伤造成神经元坏死，NSE从细胞中溢出，透过血脑脊液屏障进入脑脊液及血液；受损脑组织继发缺血进一步加重神经细胞损伤[17-18]。血脑屏障的基本功能在于控制进入神经组织的物质，保证中枢神经系统内环境的稳定平衡，在病理情况下血脑屏障受到破坏，结果导致内皮细胞、基膜受损，其渗透性增加，屏障作用消失。故脑损伤时S-100B蛋白及NSE首先在脑脊液中增高，之后能通过受损的血脑屏障进入外周血循环，故外周血中该两项指标滞后于脑脊液标本[19-20]。

本研究使用的MCAO模型是目前国内外最常用于研究急性脑缺血疾病的动物模型之一，其手术简单，创伤小，缝合方法简单，避免打开颅骨，能明确闭塞的精准位置，可控制缺血持续时间和再灌注[21-22]。通过一年多的动物实验，笔者在动物性别、体重、年龄、切口、结扎位置、所使用的麻醉剂以及线栓质量、硬度和直径等方面摸索成功地建立了MCAO模型[23]。通过对动物模型的研究发现：血清及脑脊液中S-100B及NSE在大脑中动脉栓塞术后不同时间段呈趋势性变化，脑脊液中S-100B及NSE水平增高时间均早于外周血，且脑脊液中的水平增高是外周血的几十倍甚至几百倍，特别是脑脊液中S-100B蛋白在脑损伤8 h即可增高，1 d达到峰值，而NSE在脑损伤后12 h脑脊液中即可达到峰值，持续到5 d后下降，5 d后NSE水平与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；而血清中S-100B及NSE水平在发病后12 h开始增高，3 d达到峰值，之后逐渐下降，7 d后与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

本研究还对术后SD大鼠进行行为学评价及脑梗死体积测量[24]，针对不同行为学评价得分及不同梗死体积给出了血液、脑脊液中S-100B及NSE参考区间，并且通过分析相关性发现无论是血液还是脑脊液中S-100B及NSE结果与梗死面积及神经功能评分均呈正相关，脑脊液中两指标的相关系数高于外周血，尤其在神经功能评分大于2分、脑梗死面积大于全脑10%时，两指标结果显著增高，且脑脊液中检测结果远远高于外周血检测结果，充分验证了S-100B及NSE在大脑中的特异性及脑脊液检测的灵敏性均高于外周血。

脑卒中患者临床病人研究有较多局限，首先患者基础病较多，导致外源性影响因素较大，梗死面积及部位不同，检测指标有所波动，若疾病进展过程中发生二次梗死，造成结果再次升高，给实验结果的处理带来一定的影响；其次，患者发病时间较难控制，当有症状就医之后基本超过发病8 h以上，故不能准确评估发病时间与检测指标水平高低的相关性[25]；再次，在国内脑卒中患者采集脑脊液几率小，若按时间段搜集脑脊液标本更加困难；综上所述，按照不同时间段搜集人体外周血及脑脊液样本影响因素较多，故一般采用动物实验研究。