游离DNA检测在结核病诊断中的研究进展

韩 冰，胡柳杨 综述，曹东林 审校

广东省第二人民医院检验医学部，广东广州 510317

结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性感染性疾病，在全球范围内尤其是发展中国家仍处于高发状态。现有的临床诊断技术中，传统显微镜检查阳性率低，细菌培养时效性差，影像学表现特异度较低，虽然免疫学和分子生物学技术在诊断灵敏度和检测速度等方面与经典方法相比有了很大改进，但仍存在成本高、结果难以规范化等诸多问题，延缓了世界卫生组织“结束结核病战略”的进展。为弥补液标本采集和应用的不足，解决当前诊断技术中存在的各种问题，血液、尿液等非痰液标本中结核分枝杆菌游离DNA(cfDNA)的检测应运而生，为实现肺结核的准确快速诊断和肺外结核的有效检出开辟了途径。本文针对cfDNA检测在结核病诊断中的研究进展及临床应用价值作如下综述。

1 cfDNA的发现及应用现状

cfDNA又称循环DNA，是一种存在于生物体液中无细胞状态的胞外DNA片段(80～200 bp)，它主要以DNA-蛋白质复合物的形式存在，在人体血液、尿液、脑脊液等多种体液中均可检出。1948年，MANDEL等[1]首次对cfDNA进行了描述，但在当时他们的发现并没有引起业界关注。发展到1989年，STROUN等[2]发现血浆中cfDNA具有肿瘤细胞DNA的一些特征，通过对肿瘤患者体内的循环DNA序列进行测定，结果显示检出的癌基因突变与原发肿瘤一致。随后，LO等[3]首先在孕妇血浆中发现并且应用PCR技术检测到胎儿DNA，这种胎儿DNA最早可在妊娠第7周被检测出，并随妊娠进展而升高，有可能成为无创产前诊断的理论基础，这一发现被认为是cfDNA研究领域的重大突破。近年来，cfDNA检测在小细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌等恶性肿瘤的诊断和病程监测中取得了较大的进展，在孕妇产前诊断以及妊娠相关疾病监测中的应用价值也不断被发掘[4-5]。除了肿瘤学和胚胎学外，cfDNA检测也成为糖尿病、心脑血管疾病等其他疾病诊断和治疗的研究热点[6-7]。

有研究指出，cfDNA也存在于细菌、寄生虫等微生物中，当人体感染某种病原体时可在体液中检测出相应的cfDNA分子，它在感染性疾病的无创诊断和疗效观察等方面具有较强优势[8]。WEERAKOON等[9]对血吸虫病流行地区居民粪便、血清、尿液、唾液中日本血吸虫cfDNA进行了定量检测，发现不同标本中cfDNA检测(47.6%～74.5%)与显微镜检查(26.2%)相比均获得更高的诊断灵敏度，这种非侵入性技术已被证实可用于监测血吸虫病治疗效果和解决诊断难题。虽然cfDNA的产生机制仍不十分明确，尚不能直接应用于临床，但毫无疑问的是它与部分感染性疾病的发生和发展有着密切的联系。

2 不同标本中结核分枝杆菌cfDNA的检测

目前，在结核病分子生物学诊断中检测的多为痰液中结核分枝杆菌基因组核酸。相较于痰液，血液、尿液等临床标本更易采集且不需要进行前处理，对于无呼吸系统损害的肺外结核或婴幼儿等难以提供痰液的可疑肺结核患者是一种较易获得的标本类型。并且通过PCR技术可将人体血液、尿液、胸腔积液等体液标本中的结核分枝杆菌cfDNA进行检测。

2.1血液标本cfDNA的检测 2016年，USHIO等[10]采用数字PCR技术成功地从全血细胞微球中直接提取并检测到结核分枝杆菌cfDNA，但这项研究未能排除检测到菌体基因组DNA的可能性。2018年，CLICK等[11]首次运用荧光定量PCR(FQ-PCR)技术证实了血浆结核分枝杆菌cfDNA检测应用于结核病诊断的可行性，并与血培养结果对比明确了血液中的结核活菌并非所检测到的游离DNA来源。2018年，YAMAMOTO等[12]报告了1例血液、痰液标本经抗酸染色镜检以及基因组DNA测定均为阴性的血行播散型肺结核患者，应用数字PCR技术可检测到患者血液标本中的结核分枝杆菌cfDNA，进一步验证了检测到的核酸片段并非来自菌血症患者血液中活菌体内的基因组DNA。YANG等[13]通过数字PCR技术分别检测肺结核和肺外结核患者血液标本中cfDNA，发现了这种方法在肺外结核诊断中的潜在价值。此外，血浆cfDNA水平及其完整性的检测在结核病鉴别诊断中也有重要价值，对非小细胞肺癌与结核病的鉴别作用优于传统肿瘤标志物[14]。

2.2胸腔积液cfDNA的检测 2017年新修订的肺结核诊断标准将胸膜部的结核病变归入肺结核范畴。结核性胸膜炎患者常合并有胸腔积液，生化检查是判断病变性质的常规方法，近年来，有研究者试图通过检测胸腔积液中结核分枝杆菌cfDNA来实现结核病的诊断。cfDNA在菌体受到免疫细胞攻击后裂解释放进入患者体液循环，游离在胸腔积液上清液中的小DNA片段水平远远高于基因组DNA，结核分枝杆菌的检出率明显提高。CHE等[15]通过cfDNA检测、结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(Xpert MTB/RIF)、腺苷脱氨酶检测以及细菌培养4种方法对胸腔积液中的结核分枝杆菌进行测定，结果显示，cfDNA检测的诊断灵敏度(75%)明显高于上述其他3种方法(20.0%，68.3%，26.7%)。我国作为结核病高发病率国家，科研人员也对这种方法的诊断效能进行了探索。通过与抗酸染色镜检和细胞基因组DNA检测比较，明确了cfDNA检测在结核性胸腔积液的诊断中具有更高的价值[16]。这些都为cfDNA应用于结核病的诊断提供了理论支持。

2.3尿液标本cfDNA的检测 尿液中病原体检测更为便捷、安全且易于操作，是一种理想的临床标本。一项对43例结核病患者和13例健康对照者尿液标本的研究显示，79%的患者尿液中可检出含有IS6110序列的游离DNA片段，而所有对照组均为阴性[17]。这表明致病菌释放的含有结核分枝杆菌特异性序列的小DNA碎片可随循环运送到肾脏最终排出体外，并在结核病患者尿液中被检出。LABUGGER等[18]研究发现，痰涂片镜检和尿液cfDNA联合检测对结核病的诊断灵敏度高达96%，进一步体现了尿液cfDNA检测在结核病诊断中的价值。而且实验监测到尿液中cfDNA浓度缓慢下降，这反映了死亡细菌的逐步清除，因此尿液中结核分枝杆菌cfDNA被认为是未来判断早期杀菌活性的候选指标，可用于评价新药或用药方案以及个体化结核病治疗的监测。

3 cfDNA检测与现有诊断技术应用价值的比较

3.1诊断灵敏度 痰涂片染色镜检仍是目前确诊肺结核最常用的方法之一。这种传统的显微镜检查操作简便、成本低，但灵敏度不高。近年来，将显微镜与发光二极管相结合研发出的发光二极管荧光显微镜(LED-FM)不断被推广，其诊断效能明显优于传统的光学显微镜[19]。但涂片时一些杂质经荧光染色后在LED-FM下也可呈现与结核分枝杆菌形态相似的黄色杆状物，因此常出现假阳性结果，是否可以在临床广泛应用仍需进一步探索[20]。对比研究发现，胸腔积液中结核分枝杆菌cfDNA检测的诊断灵敏度(63.11%)约为抗酸染色镜检(11.65%)的5倍，约为基因组DNA检测(23.30%)的3倍，阳性检出率明显提高[16]。

3.2诊断特异度 影像学表现是可疑肺结核患者在获取细菌学检验结果前明确是否该进行抗结核治疗的重要参考依据，对肺部疾病有辅助诊断价值，也可用于肺外结核的筛查[21]。但成像缺乏特异性，与肺部恶性疾病鉴别诊断时容易出现误诊、漏诊，需要结合实验室检查、病理学证据才能确诊[22]。另外，免疫学测定作为目前临床广泛应用的筛查试验，具有速度快、灵敏度高等优势，但结核菌素试验(TST)不易与卡介苗接种引起的免疫应答相鉴别，而γ-干扰素释放试验(IGRAs)检测结果又与机体所处的免疫状态密切相关，常存在较高的假阳性率[23]。目前，结核分枝杆菌cfDNA检测在多种类型标本的研究中均显现了良好的诊断特异度，同时解决了抗酸染色镜检和细菌培养中难以与非结核分枝杆菌(NTB)相鉴别的问题。FERNNDEZ-CARBALLO等[24]对4项有关血液、尿液标本中结核分枝杆菌cfDNA检测的研究进行系统性回顾，发现这种方法用于结核病诊断的特异度为89.0%～100.0%。此外，胸腔积液中结核分枝杆菌cfDNA检测的特异度(100.0%)也明显优于结核感染T细胞斑点试验(38.9%),而且cfDNA不如基因组DNA稳定，可很快被降解清除，因此检测到的cfDNA极有可能是近期被释放到患者体内的，能够反映其当下的疾病状况并且提高诊断特异度[15]。

3.3检测速度 细菌培养结合菌种鉴定是结核病诊断的“金标准”。经典的固态培养法虽然简便、经济，但培养周期长(4～8周)，严重落后于临床治疗。随着诊断技术的不断发展，分枝杆菌生长指示管检测法(MGIT)和结核分枝杆菌液体显色选择培养法(TK SLC-L)等培养法被引入临床。虽然BACTEC MGIT 960快速培养系统有效加快了诊断进程，TK SLC-L培养基可通过剔除其他污染菌种缩短污染标本重复培养时间[25]，但总体来说细菌培养时限性差，难以满足临床早诊断、早治疗的需求。相对于分离培养，用于cfDNA检测的非痰临床标本易于收集、无需经历漫长的培养周期，专用试剂盒提取标本中游离核酸片段后直接经PCR仪检测即可获得结果，有望实现结核病的快速诊断。

3.4肺外结核的诊断效能 Xpert MTB/RIF是集标本处理、DNA提取、结核分枝杆菌及利福平耐药基因检测为一体的全自动检测技术。通过与常规细菌学检查以及传统的恒温扩增技术相比较，Xpert在肺结核诊断中的高灵敏度、高特异度已经得到了广泛证实[26-27]。遗憾的是尽管多项研究证实Xpert MTB/RIF检测总体灵敏度很高，但对肺外结核的诊断效能较低。MBUH等[28]分别收集45例经细菌培养证实为肺外结核患者的淋巴抽吸液、胸腔积液、腹水、脑脊液等非痰液标本进行Xpert MTB/RIF检测，阳性检出率分别为66.5%、15.6%、11.1%、2.2%。而同样作为分子生物学诊断技术的cfDNA检测一定程度上可弥补Xpert MTB/RIF的不足。SANTOS等[29]利用FQ-PCR技术分别检测38例确诊肺外结核患者的血液、尿液、活组织标本以及胸腔积液、腹水等肺外体液中的结核分枝杆菌cfDNA，阳性检出率分别为55.9%、33.3%、43.8%、29.6%，而且联合检测血液、尿液标本可将灵敏度提高至68.8%。这与机体感染结核分枝杆菌后免疫系统通过分泌相应的细胞因子发生免疫应答来对抗感染密切相关，病原体遭到破坏后释放的cfDNA可随宿主细胞外液循环到达各处[30]，即未发生菌血症的肺外结核患者仍可在体液中检测到cfDNA，为肺外结核的有效诊断提供了新方法。

4 影响结核分枝杆菌cfDNA诊断效能的因素

4.1特异性引物 插入序列 IS6110的多个拷贝被证实特异地存在于结核分枝杆菌复合群基因组中，在人型结核分枝杆菌中以10～12个拷贝存在，牛型分枝杆菌只有1～3个拷贝，而其他分枝杆菌DNA中均未检出IS6110[15]，是目前结核病分子生物学诊断中最常用的核酸扩增靶点之一。此外，插入序列 IS1081、23S rRNA也是结核分枝杆菌检测的有效靶点[31]。针对上述靶点设计引物可有效提高结核分枝杆菌cfDNA检测的特异性。

4.2标本保存 许多研究发现，并非所有病例均能检测出阳性结果，部分FQ-PCR阳性标本有较高的阈值(Ct)，这表明部分DNA靶点水平接近检测极限，必须减少标本中cfDNA的降解和背景DNA影响。美国Streck公司研发的加入了血液标本稳定剂 BCT的cfDNA采血管被证实在模拟样品储存和运输过程中可降低细胞基因组DNA的释放，检测时可明显减少背景DNA的干扰。MEDINA等[32]分别用Streck cfDNA BCT采血管和标准EDTA-K2采血管采集健康人静脉血，室温保存5 d后发现BCT管中DNA水平仍保持稳定而EDTA-K2管中血浆总DNA和基因组DNA的水平明显增加。说明这种新型采血装置可以有效防止血液样品中有核细胞断裂释放基因组DNA而引起的污染，实现低丰度cfDNA的精准检测。

4.3标本量 生物样品中cfDNA的浓度是影响检测结果的决定性因素，这与所收集标本量的多少密切相关。有学者根据当前结核分枝杆菌cfDNA检测的相关研究指出，基于核酸扩增的测定中检测限应为10拷贝/微升，即至少需要收集5 mL体液标本才能实现cfDNA的检出[24]。更大容量的标本可以进一步改善cfDNA的检出情况，9 mL血液标本提取检测结核分枝杆菌cfDNA的灵敏度(71%)明显高于2 mL提取方案(33%)[33]。鉴于对大量标本的需求，尿液将是儿童可疑病例检查的首选标本。

4.4cfDNA提取方法 不同的方法对标本中游离DNA的提取效率不同。MAUGER等[34]对11种不同的提取方法进行了综合比较，结果显示，QIAamp循环核酸提取试剂盒和Norgen循环核酸纯化试剂盒的准确性和重复性最好。由于cfDNA片段小、易降解，导致其在提取过程中容易丢失，选择优质的提取方法能够提高检测灵敏度。

5 未来研究展望

cfDNA可以识别体内多个部位的疾病，并潜在地监测目前无法用经典微生物学方法识别的疾病状态。临床标本中结核分枝杆菌cfDNA浓度范围的评价应成为结核cfDNA研究的一个重要目标，这不仅是诊断的关键，对疗效监测也有重要价值，而且标本中cfDNA浓度的估算对标本制备和检测平台开发(检测限)也具有重要意义。另一方面，目前针对儿童患者以及人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者的研究有限，而鉴于痰液标本的不易获得，这些患者将是从cfDNA分析中获益最大的群体，可考虑进一步探索HIV阳性和儿童患者体液中结核分枝杆菌的cfDNA检测。

6 结 语

综上所述，通过PCR技术检测结核病患者血液、尿液、胸腔积液等标本中的cfDNA是切实可行的，并且在检测速度、灵敏度、特异度、适用广度等多个方面均显现了优势。虽然目前cfDNA作为结核病生物标志物的研究尚处于起步阶段，然而，它的巨大潜力正推动这一领域逐渐获得更多的关注，而且已有多种插入序列被证实为结核分枝杆菌所特有，市场上也已推出可以减少背景DNA释放的采血装置，有理由相信通过设计特异性引物和优化目标DNA提取等多种方法，可以提高结核分枝杆菌cfDNA的诊断效能，这种新型的分子生物学技术经过不断改良可以开创结核病快速诊断的新局面。