致耐受性细胞对自身免疫性甲状腺炎的治疗作用研究进展

任子愚，陶玥廷，冉涛，周敏，刘东方

重庆医科大学附属第二医院内分泌代谢科，重庆 400010

传统意义上的自身免疫性疾病是指特征性的全身反应性淋巴细胞激活，通过形成对抗宿主组织的自身抗体或内源性蛋白特异性的效应T细胞，引起急慢性炎症反应损伤组织器官的一类疾病[1-2]。自身免疫性甲状腺炎(autoimmune thyroiditis，AIT)一般称为桥本甲状腺炎(Hashimoto thyroiditis，HT)，又称慢性淋巴细胞性甲状腺炎，是一组颇具特色的疾病类型，其特征为免疫细胞的弥漫性炎性浸润，淋巴细胞及间质细胞取代甲状腺实质并诱导甲状腺肿大，最终导致腺体纤维化及甲状腺激素分泌减少，从而造成临床甲状腺功能减退[3]。AIT的确切发病机制目前尚不清楚，基因遗传多态性在其中具有重要作用，且环境因素、抗原呈递、细胞因子失调及淋巴细胞活化的调控均起着关键作用。除此之外，家族内自身免疫性甲状腺疾病的聚集证明了常见的遗传易感性也参与了疾病的发生发展[4]。针对此类患者，目前临床上的治疗选择很少，大多数患者需要长期服用甲状腺素来控制病情，对于免疫调控途径的问题尚无良好的解决方法。不仅AIT，其他绝大多数的自身免疫性疾病，如类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)、多发性硬化症(multiple sclerosis，MS)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)等，均需依靠药物长期维持。有研究表明，约30%的RA患者可以依靠药物治疗达到持续缓解，但如果中止治疗，50%甚至更多的患者会复发[5-6]。而在过去的半个多世纪中，对于自身免疫性疾病的治疗主要依靠免疫抑制疗法，如皮质醇及细胞毒剂等，但这种治疗方式带来的不利影响也随着时间的推移逐渐显露，如往往会全面抑制机体的免疫反应，从而使感染风险明显升高，甚至增加恶性肿瘤的罹患率[6]。

1 致耐受性细胞

近年来，大量研究转至免疫调控方面，提出自身免疫性疾病治疗的重点是恢复机体的免疫耐受性。诱导耐受性的治疗方式提供了一种将“患病”的免疫系统“重置”为免疫耐受状态的机会，致耐受性细胞(tolerogenic cells)这个概念也应运而生。经过体外扩增后移植进入患者体内，使机体恢复对自身抗原或是同种抗原的免疫耐受性的一类细胞被称为致耐受性细胞[7]。目前研究主要发现有3类致耐受性细胞，分别为间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)、调节性T细胞(regulatory T cells，Tregs)及致耐受性树突细胞(tolerogenic dendritic cells，tolDC)。致耐受性细胞也逐渐成为自身免疫性疾病的治疗重点[8]。本文将主要围绕这3类致耐受性细胞进行介绍。

1.1 MSCs 众所周知，MSCs是一种具有多向分化潜能的多能干细胞，可以从中胚层分化为多谱系细胞[9]，也可以从多种组织中分离及增殖，如脂肪组织、皮肤、牙髓、羊膜及脐带等[10]。除了传统的“细胞替代”——从中胚层分化为多谱系细胞以替代病变的细胞组织外，MSCs还具有独特的免疫调控作用，即通过间接作用于一系列可溶性细胞因子，从免疫学层面调控多种抑炎因子释放，使机体获得免疫耐受性，保持组织稳态[11]。

正是因为MSCs独特的免疫调控功能，使之成为自身免疫性疾病极佳的治疗选择。从定义上看，MSCs必须具有以下几个特征：①具有特征性的成纤维细胞纺锤样结构；②在体外能诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞；③经过流式细胞检测，其在表型上白细胞分化抗原(cluster of differentiation，CD)105、CD73及CD90呈阳性，CD45、CD34、CD14、CD11b、CD3及CD19则呈阴性[12]。MSCs具有通过细胞间接触及旁分泌相互作用，借助多种可溶性介质(吲哚胺-2,3-双加氧酶、前列腺素E2及转化生长因子β等)[13]参与调节先天性及适应性免疫细胞的功能，可抑制效应性T细胞增殖并促进其分化为抑炎表型的Tregs[14]，并能抑制CD4+T细胞诱导的B细胞向浆细胞分化并直接抑制B细胞的增殖、分化及趋化性，减少炎性细胞因子分泌，从而减轻自身免疫性疾病的炎症反应。

1.2 Tregs Tregs是机体内一组表达CD4、CD25及细胞内叉头样转录因子3(forkhead box P3，FoxP3)蛋白的T细胞集合，它的主要作用是抑制效应T细胞及其他免疫效应细胞的功能，以减少炎性因子的释放，因此在获得免疫耐受性的过程中必不可少[15]。有研究发现，天然性CD25+CD4+FoxP3+Tregs缺乏或具有突变FoxP3基因的个体均会出现严重的自身免疫性疾病或变态反应[16]。近年来，Tregs也被广泛用于维持免疫稳态的研究和治疗中。

Tregs免疫调控作用的具体机制目前尚不明确，可能有数种潜在机制共同存在。有研究利用一种短期体外测定啮齿动物CD25+CD4+抑制活性的监测技术发现，在存在抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)的前提下，人类及啮齿动物的Tregs与特异性抗原或多克隆T细胞抗原受体刺激因子(如anti-CD3 mAb)共培养时，CD4+CD25+Tregs可有效抑制其他CD4+及CD8+反应性T细胞的增殖[17]；此外，CD4+CD25+Tregs还能抑制反应性T细胞的细胞因子(特别是白细胞介素-2)的产生及其效应物活性，提示Tregs在维持自我耐受及免疫稳态时是依靠多种机制相互作用的，从而起到协同效应。

1.3 tolDC 树突细胞(dendritic cells，DC)是一种起源于骨髓造血干细胞的APC，当其被活化时，会迁移至淋巴组织中与T、B细胞相互作用，以刺激调控免疫反应。成熟的DC表达高水平的共刺激因子及黏附因子。DC在成熟过程中，由接触抗原的外周组织迁移至次级淋巴器官，与T细胞接触并激发免疫应答[18]。作为目前发现的功能最强的APC，在自身免疫性疾病中，DC会偏向促炎状态，产生更多炎性因子并导致自身反应性T细胞增殖分化，甚至能够诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)生成，产生剧烈的免疫炎症反应。DC引起的免疫应答强度及类型取决于多种因素，包括抗原性质、DC类型及成熟状态，以及其产生某些细胞因子的能力[19]。

值得注意的是，这样一种功能强大的APC同时还具有重塑免疫耐受性的功能。典型DC一般可分为经典型DCs(classical DCs)及浆细胞性DCs(plasmocytoid DCs)两类[20]。而近年的前沿研究发现还存在一类“新型”树突细胞——tolDC，其功能正好与传统APC相反，在协调中枢及外周免疫耐受过程中起着至关重要的作用。这一类DC并不是独立的新型种群，而是一部分活化状态不同的DC集合。它们的调节功能取决于其激活状态的差异。有研究发现，使用对表面抗原有反应性的DC-限制性内膜细胞受体(DC-restricted endocytic receptor，DEC-205)结合鸡蛋溶菌酶(hen egg lysozyme，HEL)在体内将抗原递送至DC可诱导短暂的抗原特异性T细胞活化，继而引起T细胞无应答及缺失[21]。当使用自身抗原及DEC-205反应性抗体的融合物改善实验性自身免疫模型时，也观察到了相似的效果。越来越多的证据表明，一些独特激活状态下的DC可响应白细胞介素(interleukin，IL)-10、IL-27、维生素A或芳烃受体配体等触发的信号，从而限制效应T细胞并提高免疫耐受性[22-23]。

AIT是一种常见的器官特异性自身免疫炎症，好发于女性，环境、遗传、基因易感性等多种因素导致了该疾病的发生发展，但其根本致病机制尚不清楚。该病的主要病理改变包括甲状腺内淋巴细胞浸润、循环甲状腺自身抗体激增，同时伴随着甲状腺功能的减退，并可与其他多种自身免疫性疾病伴随发生。该病主要是由于甲状腺细胞对其自身抗原如甲状腺过氧化物酶(TPO)、甲状腺球蛋白(Tg)及甲状腺刺激激素受体(TSH-R)的免疫耐受性丧失，机体形成对抗宿主组织的自身抗体或是对内源性自身肽特异的效应T淋巴细胞，从而引起急慢性炎症反应[24]。体内高浓度甲状腺自身抗体可介导产生高水平促炎细胞因子如干扰素(interferon，IFN)-γ、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α等，溶解正常甲状腺滤泡细胞，而活化的效应T淋巴细胞则浸润至甲状腺腺体组织中。这些促炎细胞因子会诱发甲状腺上皮细胞表达主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)-Ⅱ类抗原，MHC-Ⅱ类抗原可能有助于自身反应性T细胞群扩增并延长炎症反应，从而进一步活化淋巴细胞，产生恶性循环，使患者甲状腺组织破坏逐渐加重[25]。漫长且复杂的治疗方式也使研究者们逐渐将焦点转移至致耐受性细胞。

2 致耐受性细胞治疗效应的表达

目前，尚不清楚致耐受性细胞作为一种外源性体细胞是如何在机体内产生治疗作用的。一些研究发现，上述3种致耐受性细胞(MSCs、Tregs、tolDC)均可表达归巢效应，这也使它们在细胞移植后可以从移植部位经过激活部位(区域淋巴结)最终迁移至靶器官及组织，从而产生治疗修复效果[26-27]。以Tregs为例，大多数的Tregs表面表达L-选择素，这使其可进入外周淋巴组织。而且有报道指出，经过体内抗原刺激后，炎症趋化因子受体[chemokine (C-C motif) receptor，CCR]2、CCR4、CCR5、CCR8及调节亚群上的黏附分子如CD54和淋巴细胞功能相关抗原(lymphocyte functionassociated antigen，LFA)-1类分子水平明显增高，这表明Tregs能够进入炎症组织并可能直接作用于炎症部位，从而证实其具有归巢能力[27]。而MSCs及tolDC相继被证实具有类似的归巢特性。细胞可通过趋化性迁移至靶器官或组织，产生特异性的治疗效应，这种特性也可能是致耐受性细胞发挥免疫调控作用的关键方式。

3 致耐受性细胞治疗自身免疫性甲状腺炎

3.1 MSCs在实验性自身免疫性甲状腺炎(experimental autoimmune thyroiditis，EAT)动物模型中的治疗效果 Tan等[28]利用外源性猪甲状腺球蛋白混合弗氏佐剂建立起CBA/J小鼠EAT模型，被激活的B细胞及反应性T细胞特异性识别自身抗原，导致小鼠甲状腺组织损伤。该研究将EAT小鼠分为4个实验组和4个未经处理的对照组，在不同时间点通过尾静脉分别向实验组小鼠注射人羊膜来源间充质干细胞(HA-MSCs)，尽管注射时间各异，但4个实验组小鼠血清甲状腺自身抗体(TPOAb、TgAb)水平均低于4个未处理对照组；且在注射干细胞治疗后，实验组小鼠血清B10细胞表达明显上升，而B10细胞被证实是产生IL-10的主要来源，可抑制Th17细胞的分化[29]。此外，注射干细胞的小鼠血清中的Th17细胞也明显下调，因此，MSCs可能是通过上调机体B10细胞、抑制Th17细胞分化而发挥治疗EAT的作用的[28]。同样的结果也在另一研究中得到证实，该研究利用同样的方法建立EAT大鼠模型，在经过外源性注射人来源脐带MSCs后，干细胞处理组大鼠甲状腺组织切片中的淋巴细胞浸润较普通EAT组明显减少，甲状腺滤泡的破坏程度明显减轻，大鼠血清中的Th17细胞比例也明显下降[30]。

韩国首尔三星生物中心的Choi等[31]利用脂肪来源的间充质干细胞(ADSCs)在C57BL/6小鼠EAT模型中同样取得了良好的治疗效果：与对照组相比，注射ADSCs的实验组小鼠血清IFN-γ、IL-6、IL-2及TNF-α等促炎因子水平降低，IFN-γ/IL-4比值下降了约1/3；且与对照组相比，实验组小鼠表型为CD11b阳性的脾细胞数目、脾脏CD4+/IL-17+细胞比值均降低，而脾脏中Tregs数量则明显上升；实验组小鼠血清自身抗体水平明显改善。尽管缺乏相关临床细胞移植治疗的案例，但是MSCs移植作为一种体细胞移植疗法，诱导AIT模型自身反应性淋巴细胞产生耐受性的治疗价值不可忽视。

3.2 Tregs对EAT的免疫调节机制 早在2003年，Hori等[32]首次对Treg细胞这类特殊T细胞亚群进行了详尽的描述。此类淋巴细胞为特征性表达转录因子FoxP3及高水平的IL-2受体α链的CD4+细胞。这些细胞最初被命名为天然Treg(nTreg)淋巴细胞，它们表现出明显的抑制效应T淋巴细胞激活、增殖和炎性细胞因子合成的能力。Verginis等[33]研究发现，在转基因CBA/J小鼠模型中激活CD4+CD25+Tregs，可以抑制Tg诱导的EAT生成。多组动物实验均证实Tregs在下调甲状腺组织自身免疫反应中起重要作用。Pan等[34]的另一项临床研究同样揭示了Tregs在抗自身免疫炎症方面的独特效应：在AIT受试者中，未经治疗的患者血清Tregs水平与对照组相似，但明显低于经过数月治疗后的AIT患者水平。该研究还发现Tregs会转化为不同的亚群而发挥治疗作用，如CD4+CD69+T淋巴细胞、CD4+NKG2D+细胞等，可表达IL-10、糖皮质激素诱导TNF受体及转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β以产生免疫调控作用。

Tregs治疗EAT主要是利用细胞内信号传导通路调控Th17/Tregs平衡，中和相关炎性信号因子，改善机体免疫耐受性以达到控制自身免疫炎症的目的。Th17/Tregs平衡在AIT致病机制中至关重要，两种细胞在AIT的发生发展中起完全相反的作用。Th17细胞促进自身免疫反应，而Tregs通过维持自身免疫耐受以控制自身反应性T效应细胞的扩增及激活[35]。有研究发现，在格雷夫斯病(Graves disease，GD)患者外周血中，Th17比例及绝对数量较普通人群均有所增加，且致病性Th17细胞及IL-17水平与格雷夫斯眼病严重程度呈正相关[36-37]。Marazuela等[38]则在AIT患者外周血中观察到Th17细胞水平及分化程度升高，IL-17生成增多。这些证据表明，致耐受性细胞疗法的目的是直接或间接增加机体内的Tregs表达量以调控机体免疫耐受性。Tregs在AIT疾病的进展及转归中占据了至关重要的地位。

3.3 tolDC对AIT的治疗作用 Verginis等[33]研究发现，利用TNF-α处理并结合Tg刺激致半成熟状态的骨髓源性DC可以抑制Tg性EAT的进展，该处理方法在小鼠模型体内激活了Tg特异性CD4+CD25+细胞，能在特异性识别Tg后分泌抗炎因子IL-10，并表达与Treg相关的表面标志物。Tg刺激产生的半成熟DC在EAT中的致耐受潜力可能是由选择性激活的Tg特异性CD4+CD25+Treg细胞介导的。

同样的情况出现在Vasu等[39]的研究中，研究者发现小鼠来源甲状腺球蛋白(mTg)可使CBA/J小鼠呈现自身免疫甲状腺炎状态，但在mTg免疫前给予小鼠Fms样酪氨酸激酶受体3-配体(Flt3-L)预处理的DC，可使甲状腺炎会进一步加重，相反，如果给予小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)处理的DC则可使小鼠产生免疫抑制效果而不会发展成EAT。这些经GM-CSF治疗小鼠的外周血淋巴细胞在体外用mTg刺激后产生更高水平的IL-4及IL-10，体内也表达更高水平的CD4+CD25+细胞，从而抑制了mTg特异性T细胞反应。上述结果表明，tolDC似乎是通过间接激活机体内CD4+CD25+细胞产生IL-10等抗炎因子而发挥增强机体免疫耐受性的效果。这一细胞因子作用途径也为AIT的治疗提供了新的研究方向。

3.4 其他致耐受性细胞治疗AIT的效果 2017年，在德国柏林由Coppola等[40]进行的一项人角膜缘干细胞(fibroblast-like limbal stem cells，f-LSC)诱导免疫耐受从而治疗AIT的临床试验中，纳入了31位血清高浓度TPOAb、TgAb的女性AIT患者，分离并提取其血液中的T淋巴细胞并与f-LSC共培养，结果发现f-LSC由于细胞间接触反应及多种可溶性细胞因子的生成达到低免疫原性状态，而激活T淋巴细胞所需的一系列细胞因子表达则明显减少。f-LSCs增强了程序性死亡配体1和2、吲哚胺-吡咯-2,3-双加氧酶、IL-6及单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)等免疫抑制因子的表达，同时维持了MHC-Ⅱ类分子及共刺激分子的阴性表型。在共培养实验中，f-LSC抑制了40%以上健康外周血单核细胞的活化，同时促进了免疫调节剂标志物CD69的持续表达。在共培养条件下，那些来源于女性AIT患者的自身反应T细胞Th1/Th2失衡均全面恢复。尽管在离体细胞共培养实验中取得了良好效果，但该团队并未进行后续的临床移植试验。

综上所述，本文主要综述了3种致耐受性细胞在AIT中耐受性重塑的部分机制。但大多结论依靠动物模型及少量的离体临床研究得出，而在实际的临床治疗中能否取得疗效仍缺乏系统性的临床试验佐证。致耐受性细胞治疗AIT具有良好的研究前景，随着科技水平的不断发展，致耐受性细胞无疑能改善传统的AIT治疗模式，为今后的临床治疗提供新方向。