促红细胞生成素对大鼠即刻再植牙牙髓血运重建的促进作用

李雪洋，尹 硕，谢金芳，李 晶，胡 雪，耿文韬，张颖丽

(1.吉林大学口腔医院牙体牙髓科，吉林 长春 130021;2.吉林省长春市口腔医院修复科，吉林 长春 130022)

牙外伤作为临床上十分普遍的牙急性损伤， 多发生于年轻恒牙[1],而牙外伤中以牙脱位较为常见，此时青少年正处于生长发育期，根尖孔尚未完全闭合。牙脱位会带来美学、功能和心理上的负担，鉴于生物学和心理学上的支持[2]，国际牙外伤协会(IADT)指南建议即刻再植是治疗牙脱位的最佳方法，同时该指南指出为了获得牙髓血运重建和牙根的持续发育，对根尖孔开放的全脱位牙来说，除非有临床或影像学证据显示牙髓坏死，否则应避免进行根管治疗[3]。MELO等[4]研究表明：在理想的情况下，牙髓的血运重建和牙根的继续发育是可能发生的，因此再植牙的牙髓治疗并不适用于牙根尚未发育完全的牙齿。随着研究的深入，人们逐渐认识到牙髓细胞具有再生潜能，细胞迁移和血管新生在牙髓修复再生中均具有重要的作用[5-6]。因此，如何诱导牙髓组织内血管新生以发挥牙髓的防御修复潜能，是牙髓修复再生和临床活髓保存研究的重点。研究[7-10]显示：促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)可通过募集基质细胞至受损区域促进组织的再生修复，体内外实验也已证实EPO在脑缺血再灌注的保护、烧伤皮肤的愈合和股骨头坏死修复中均发挥了促进血管新生的作用。目前对于再植牙的研究则大多集中于储存介质和牙周组织的愈合[11]，而EPO在再植牙牙髓修复方面的研究较少。因此本研究旨在探讨EPO对再植牙牙髓血运重建的影响，为研究牙髓损伤的修复再生提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂及仪器 80只3周龄雄性Wistar大鼠购自吉林大学实验动物中心，动物许可证号:SCXF(吉)2015-0001，标准饲粮、随机加水喂养，使其适应环境1周，术前体质量约100 g。EPO(沈阳三生制药有限责任公司)，庆大霉素(上海现代哈森药业有限公司)，生理盐水(辽宁民康药业有限公司)， 血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial cell growth factor，VEGF)抗体和SABC免疫组织化学染色试剂盒(武汉博士生物工程有限公司)，DAB显色试剂盒(北京中山金桥生物技术有限公司)。双目光学显微镜(吉林大学口腔医院病理教研室提供，配有日本QLYMPUS照相机)。Image Pro Plus 6.0(For windows)专业图像分析软件包，SPSS 24.0统计软件。

1.2 实验动物分组和给药 80只4周龄雄性Wistar大鼠随机分为未拔牙组、阴性对照(生理盐水)组、阳性药对照(庆大霉素)组和EPO组，再根据观察时间随机分为3、7、14、21和28 d组。除外未拔牙组，其他3组大鼠固定后用30 g ·L-1水合氯醛(30 mL·kg-1体质量)腹腔注射麻醉，显效后用自制拔牙钳完整拔出上颌第一磨牙，将拔出的牙齿置于无菌一次性器械盘中，分别在生理盐水、庆大霉素和EPO溶液中浸泡4 min，再轻柔地植回牙槽窝内，实现牙齿在5 min内再植。牙再植术后严密观察大鼠复苏情况，自由饮水和摄食，每100 g饲料中混入阿莫西林0.5 g，疗程为1周。

1.3 标本采集和处理 分别在再植术后3、7、14、21和28 d取各组大鼠上颌第一磨牙及其周围组织，用 4%多聚甲醛溶液4℃下固定24～48 h，于10%EDTA溶液中脱钙12周，然后将标本放入梯度乙醇中脱水，浸蜡，包埋，通过牙齿颊舌面沿牙齿长轴过根尖孔做厚度为3 μm的连续切片。

1.4 免疫组织化学染色和HE染色 将石蜡切片放入烤箱中2 h，常规脱蜡水化，PBS冲洗后用3%双氧水灭活10 min，PBS洗3次；再放入EDTA抗原修复液中进行高压修复2 min，待冷却至室温时，PBS洗3次；随后滴加5%BSA封闭液封闭30 min，滴加VEGF抗体过夜；隔天PBS洗3次后滴加二抗30 min，PBS冲洗后滴加SABC 30 min，PBS冲洗后滴加DAB显示剂，显微镜下观察反应，终止后复染、分色、返蓝和透明，中性树脂封片，400倍显微镜下观察拍照，观察VEGF阳性表达情况，用Image Pro Plus 6.0专业图像分析软件包测定上述切片中VEGF平均吸光度(AOD)值，代表VEGF蛋白表达水平。经HE染色，中性树脂封片，200倍显微镜下观察再植牙的牙根发育情况。

2 结 果

2.1 免疫组织化学染色检测各组大鼠牙体组织中VEGF蛋白表达 各组大鼠再植牙牙体组织中，成牙本质细胞、前期牙本质、血管内皮细胞和牙髓细胞中VEGF蛋白呈阳性表达；与固有髓核比较，各组大鼠牙体组织中VEGF蛋白在成牙本质细胞层阳性表达出现的时间较早且较强。与未拔牙组比较，其他3组大鼠再植牙牙体组织在3、7和14 d时 VEGF蛋白呈强阳性表达，随着时间的推移，VEGF蛋白阳性表达强度逐渐减弱。与未拔牙组和生理盐水组比较，庆大霉素组和EPO组大鼠再植牙牙体组织中VEGF蛋白的表达均较强。见图1(插页四)。

A-D:3 d;E-H:7 d;I-L:14 d;M-P:21 d;Q-T:28 d;A,E,L,M,Q:Non-tooth extraction group;B,F,J,N,R:Saline group;C,G,K,O,S:Gentamycin group;D,H,L,P,T:EPO group.
图1 术后不同时间各组大鼠再植牙牙体组织中VEGF蛋白表达情况(免疫组织化学， ×400)
Fig.1 Expressions of VEGF protein in tooth tissue of replanted teeth of rats in various groups at different time after operation(Immunohistochemistry， ×400 )

2.2 各组大鼠再植牙牙体组织中VEGF蛋白表达水平 未拔牙组、生理盐水组、庆大霉素组和EPO组大鼠再植牙牙体组织的AOD值从高到低依次为：EPO组>庆大霉素组>生理盐水组>未拔牙组。与未拔牙组比较，3、7、14和21 d 时生理盐水组、庆大霉素组和EPO组大鼠再植牙牙体组织中VEGF蛋白表达水平明显升高(P<0.05)，而28 d时各组大鼠再植牙牙体组织中VEGF蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)；与生理盐水组比较，3、7、14和21 d时庆大霉素组和EPO组大鼠再植牙牙体组织VEGF蛋白表达水平明显升高(P<0.05)，而在28 d时VEGF蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)； 与庆大霉素组比较，术后各时间点EPO组大鼠再植牙牙体组织中VEGF蛋白表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 不同时间点各组大鼠再植牙牙体组织中VEGF蛋白表达水平Tab.1 Expression levels of VEGF protein in odontal tissue of replanted teeth of rats in various groups at different time points

*P<0.05vsnon-tooth extraction group;△P<0.05vsnormal saline group.

2.3 HE染色观察各组大鼠再植牙牙髓血运重建情况 再植术后3 d，未拔牙组大鼠再植牙牙根持续发育，血运丰富；生理盐水组大鼠再植牙可见炎症浸润灶；庆大霉素组大鼠再植牙纤维结缔组织长入；与未拔牙组和生理盐水组比较，EPO组大鼠再植牙血管内皮细胞和血管腔数目明显增多。再植术后7 d，未拔牙组大鼠再植牙牙本质增厚；生理盐水组大鼠再植牙可见疏松结缔组织长入；庆大霉素组大鼠再植牙血管腔增多；与未拔牙组比较，EPO组大鼠再植牙可见钙化组织和修复性牙本质；与生理盐水组比较，庆大霉素组和EPO组大鼠再植牙的根尖孔均缩小。再植术后14 d，生理盐水组大鼠再植牙血管充血扩张；庆大霉素组大鼠再植牙开始出现钙化；与未拔牙组比较，EPO组大鼠再植牙髓腔内出现类骨样组织，牙本质小管排列紊乱。再植术后21 d， 未拔牙组和EPO组大鼠再植牙根管壁持续增厚；生理盐水组大鼠再植牙出现牙髓坏死；庆大霉素组大鼠再植牙可见牙骨质和修复性牙本质沉积，根尖孔缩小。 再植术后28 d， 未拔牙组和EPO组大鼠再植牙牙根逐渐发育成熟；生理盐水组大鼠再植牙牙骨质处可见骨吸收陷窝和破骨细胞，出现牙根吸收；庆大霉素组大鼠再植牙髓腔内出现类骨样组织。见图2(插页四)。

A-D:3 d;E-H:7 d;I-L:14 d;M-P:21 d;Q-T:28 d;A,E,I,M,Q:Non-tooth extraction group;B,F,J,N,R:Saline group;C,G,K,O,S:Gentamycin group;D,H,L,P,T:EPO group.
图2 术后不同时间各组大鼠再植牙牙体组织形态表现(HE， ×200)
Fig.2 Morphology of tooth tissue of replanted teeth of rats in various groups at different time after operation(HE， ×200)

3 讨 论

对于牙根未发育成熟的脱位牙，实现即刻再植或再植前储存在合适的介质中，牙髓血运重建是有可能发生的[3]。研究[12-13]表明：大鼠的上颌第一磨牙在15 d时牙根开始发育，25～30 d时牙根形成1/2～2/3，大鼠的切牙末端存在被称为“apical bud”的特殊上皮结构，使切牙得以终生不断萌出。此外，有文献[14-15]指出：牙髓血运重建通常在再植后30 d左右建立，且牙周膜的修复在28 d完成。因此本实验选择4周龄大鼠的第一磨牙进行了为期28 d的观察，排除了个体自身发育的影响。

近年来研究者[16]发现了VEGF在人牙髓成纤维细胞中的表达。本研究结果显示：无论是对照组还是实验组，大鼠牙体组织中VEGF均呈阳性表达。还有研究[17]显示：牙本质基质中含有VEGF，其在损伤后从牙本质基质中释放，从而起到修复牙髓-牙本质复合体的作用。同时，成牙本质细胞的体外培养研究[18]表明：成牙本质细胞可以上调VEGF的表达。在本研究中，与固有髓核比较，成牙本质细胞层阳性表达出现的时间较早且阳性表达较强。

随着对VEGF研究的深入，有学者[19]发现：EPO通过蛋白质酪氨酸激酶2/信号传导转录激活因子3(JAK2/ STAT3)信号通路上调VEGF的表达。本研究结果显示：在再植术后3、7和14 d时EPO组和庆大霉素组大鼠再植牙牙体组织中VEGF均呈强阳性表达， 可能与该时间内成牙本质细胞变性、炎症、牙髓间充质干细胞迁移和分化、牙髓血运重建和修复性牙本质形成活跃有关[5,15，20-21]； EPO组大鼠再植牙牙体组织中VEGF表达水平略强于庆大霉素组，但差异无统计学意义，推测可能是因为在本实验中实现了即刻再植，与现实条件比较，操作均在相对无菌的条件下进行，细菌污染程度相对较轻。体外研究[22]显示：牙髓炎时，牙髓组织中EPO及其受体呈强阳性表达，表明EPO在炎症牙髓中发挥着一定的作用。并且EPO除了抗炎作用外，还具有促进血管再生、神经保护和促进成骨[7-10]的作用。最近的研究[23]表明：EPO通过促进Runt相关转录因子2(Runx2)、碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素的表达以及促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)途径上调人牙周膜间充质干细胞和牙周炎间充质干细胞的成骨能力。但本研究选择的是VEGF作为观察指标，而相关的研究[16]表明：VEGF的表达与牙髓炎中血管化的增加相一致，因此并不能说明EPO在增加再植牙成功率方面优于庆大霉素，还需要长期的观察和增加样本量以及检测细胞因子进行验证，但根据庆大霉素组和EPO组大鼠再植牙牙体组织中VEGF蛋白表达水平均强于生理盐水组和未拔牙组的结果推测，将VEGF和抗生素结合的微球作用于再植牙，可能会提高再植牙的远期成活率，这将成为本课题组未来的研究方向。

综上所述，本研究结果表明:EPO对再植牙的牙髓血运重建起到了一定的促进作用。