支气管哮喘患者CysLT1受体基因mRNA表达水平与CysLT1受体拮抗剂疗效的相关性分析

黄琳惠,董 文

海南省人民医院呼吸与危重症医学科,海南海口 570311

支气管哮喘是一种由多种炎性细胞参与、多种炎性介质介导的炎性反应,而半胱氨酰白三烯(CysLTs)在哮喘发病中发挥重要作用[1]。支气管哮喘患者会出现反复性的喘息、胸闷、咳嗽以及气促症状,且多在夜间或清晨发作。支气管哮喘的病因主要为遗传因素、变应原以及空气污染、剧烈运动等[2]。目前对于支气管哮喘暂无能够彻底治愈的治疗方案,只能通过长期规范治疗控制病情发作,减少复发[3]。本研究通过分析CysLT1受体基因mRNA的表达水平,探讨半胱氨酰白三烯受体(CysLT1受体)拮抗剂与受体基因的相关性以及临床价值,现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取本院2016年2月至2018年3月收治的支气管哮喘患者84例为研究对象。入组84例哮喘患者中,有6例在服用孟鲁司特后未达到最低有效治疗浓度,因此共78例最终完成试验,其中男41例，女37例；平均年龄(35.23±3.89)岁；平均病程(4.67±1.34)年。纳入标准：(1)符合支气管哮喘诊断标准；(2)新诊断未治疗或近1年未接受正规治疗,4周内因急性发作而入院的患者；(3)年龄>18岁；(4)配合度较高；(5)签署知情同意书。 排除标准:(1)合并严重心、肺、肝、肾等重要器官疾病患者；(2)孕妇以及哺乳期女性；(3)重度哮喘且需口服大量糖皮质激素患者；(4)合并呼吸道感染或其他肺部疾病患者；(5)语言障碍或精神疾病患者。

1.2方法

1.2.1治疗方案 患者入组后先进入洗脱期,检测1秒用力呼气容积(FEV1)和呼气峰流速(PEF),洗脱期结束后重新评估。采用CysLT1受体拮抗剂进行治疗:孟鲁司特(四川大冢制药有效公司,国药准字H20064370),10 mg/d,每日晚间服用。治疗1周后测定体内血药浓度,能够达到药物最低有效治疗浓度者维持该剂量继续服用4周,将未达到最低有效治疗浓度者剔除研究。记录洗脱期哮喘控制测试(ACT)评分、β2受体激动剂的用量、PEF及治疗后(治疗第5周)上述指标的数值。使用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测治疗前后的尿白三烯E4(LTE4)水平。

1.2.2CysLT1受体基因mRNA表达 采用两步法实时荧光PCR(RT-PCR)检测mRNA表达:CysLT1受体拮抗剂治疗前采集患者外周血5 mL,使用抗凝管保存于4 ℃环境,静置20 min后,3 000 r/min进行离心处理,使用淋巴细胞分离液将外周血单个核细胞进行分离。Trizol法抽提总RNA,并测定RNA含量。反转录:反应体系包括RNA 2 μg,Oligo(dt)0.2 μg,加DEPC水至总体积11 μL。混匀后冰水浴,加M-MLV Buffer、RNasin、dNTP与EPC至总体积19 μL,后加1 μL M-MLV。混匀后25 ℃孵育5 min、42 ℃孵育60 min。PCR反应体系:2 μL Taq Buffer、0.4 μL dNTP、1 μL cDNA模板、0.1 μL Taq酶、CysLT1上游与下游引物各0.4 μL、β-actin上游与下游引物各0.4 μL。混匀后,94 ℃下预变性1 min；94 ℃变性1 min,60 ℃下退火1 min,72 ℃下延伸1 min,共35个循环；终末延伸10 min。随后于4 ℃保存。使用电泳凝胶定位成像分析仪对凝胶进行曝光摄影,对电泳结果数据化分析后,获得CysLT1受体基因和β-actin的产物量比值,即CysLT1-receptor/β-actin。

1.3疗效评判标准 ACT评分值>20%,β2受体激动剂用量降低>20%,FEV1提高>10%,3项均符合为有效,否则为无效。

1.4观察指标

1.4.1CysLT1受体基因mRNA表达量 记录所有患者的CysLT1受体基因mRNA表达水平。

1.4.2治疗前后指标变化对比 比较治疗有效患者治疗前后ACT评分、FEV1、PEF、β2受体激动剂用量与尿LTE4指标。

2 结 果

2.1治疗效果 78例患者的CysLT1受体基因mRNA水平为1.01～3.34 CN,平均(2.24±0.34)CN。治疗后,在78例患者中，54例ACT评分值>20%,56例β2受体激动剂用量下降>20%,58例FEV1提高>10%；依评判标准,最终共40例患者符合3项标准,即有效40例(有效组),无效38例(无效组),总有效率为51.28%。两组患者年龄，哮喘持续时间，治疗前FEV1、PEF、ACT评分、β2受体激动剂用量、IgE差异均无统计学意义(P>0.05)。两组CysLT1受体基因mRNA与尿LTE4水平比较，差异有统计学意义(P<0.05),有效组均高于无效组。见表1。

2.2有效组治疗前后指标比较 治疗后,有效组ACT评分、PEF与FEV1上升,β2受体激动剂用量与尿LTE4水平下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3相关性分析 CysLT1受体基因mRNA水平与FEV1、IgE无相关性(P>0.05),与PEF水平呈负相关,与尿LTE4水平呈正相关(P<0.05)。见表3。

表1 有效组与无效组临床资料的比较

表2 有效组治疗前后的指标比较

表3 CysLT1受体基因mRNA与4种指标的相关性分析

3 讨 论

支气管哮喘是一种慢性气道炎症性疾病,由多种炎性细胞以及多种炎性介质参与、介导,因此，治疗支气管哮喘的关键在于对气管炎症的产生与发展进行有效控制。CysLTs是花生四烯酸代谢后产生的一组炎性介质,可以刺激黏液分泌[4],增加静脉与毛细血管的通透性,导致局部水肿[5]。CysLTs在呼吸道炎症中起着重要的作用,参与支气管哮喘形成、发展的各个环节。有研究表明,哮喘患者鼻腔分泌物中的CysLTs水平显著上升,明显高于健康人[6-7]。

本研究结果显示,84例患者中有78例最终纳入研究。且根据评判标准,将40例患者视为有效,38例视为无效,有效率为51.28%。其中有效组与无效组的年龄、病程等临床资料以及治疗前ACT评分、FEV1、IgE和β2受体激动剂使用量水平差异无统计学意义(P>0.05)；CysLT1受体基因mRNA、尿LTE4比较，差异有统计学意义(P<0.05),发现CysLT1受体基因mRNA、尿LTE4在有效组患者体内表达水平偏高。CysLTs受体可分为CysLT1和CysLT2,其中CysLT1在哮喘发病中起重要作用[8]。CysLT1受体在机体平滑肌细胞、嗜酸性粒细胞以及巨噬细胞中表达,激活后会导致平滑肌增生[9],嗜酸性粒细胞集聚,黏膜水肿,最终导致患者发生哮喘[10]。CysLTs可以在机体中被迅速代谢清除,氧化后的产物从胆汁和尿液中排出。LTE4是机体的一种代谢产物,含量相对稳定,有研究表明,尿LTE4占机体内CysLTs总量的4%～7%,故检测尿LTE4水平可以用来确定患者体内白三烯是否存在异常[11]。尿LTE4水平偏高时提示患者体内CysLTs水平出现异常,其检测对指导临床诊断具有一定意义[12]。

通过使用孟鲁司特治疗后,PEF、FEV1、ACT评分指标均上升,尿LTE4水平、β2受体激动剂用量均下降,提示患者症状有所缓解,病情得到有效控制。结果还显示,患者CysLT1受体基因mRNA水平与尿LTE4水平呈正相关,与PEF水平呈负相关(P<0.05),提示支气管哮喘患者的尿LTE4水平可作为CysLT1受体拮抗剂治疗的参考物,还可以作为临床治疗效果的评价指标[13]。孟鲁司特是一种非激素类抗炎药物,药物服用便捷,不良反应少,具有减少炎性细胞浸润,减轻气道反应性的功效,可降低哮喘发作,改善肺功能[14]。PEF与FEV1作为评价肺功能的常见指标,可充分反映肺功能的状态,哮喘发作会导致患者呼吸不畅,呼吸困难等症状。患者采用CysLT1受体拮抗剂治疗4周后,尿LTE4水平下降明显,且β2受体激动剂使用量降低,均说明CysLT1受体拮抗剂可有效改善病情,患者PEF与FEV1上升,说明患者肺功能有所恢复[15]。这一指标检测方法简单便捷、高效无损伤,对临床支气管哮喘患者的诊断具有重要的指导意义。

综上所述,支气管哮喘患者CysLT1受体基因mRNA的表达水平与PEF和尿LTE4水平具有相关性,且CysLT1受体拮抗剂孟鲁司特可以有效缓解患者症状,控制患者病情,临床治疗效果显著,值得推广。