SARS-CoV-2病原学特点、实验室检测及实验室生物安全防护

赖媛媛， 王宇婷， 陈家倪， 齐 军， 何振业

（1.国家癌症中心 国家肿瘤临床医学研究中心 中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院深圳医院检验科，广东 深圳 518116；2.深圳市华中科技大学协和深圳医院妇科，广东 深圳 518000）

2019年12月，武汉地区突发一种由新型冠状病毒引起的肺炎病例。2020年2月11日，世界卫生组织将这一新发传染病正式命名为新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19），同时，国际病毒分类委员会将这一新型冠状病毒命名为SARS-CoV-2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2）。SARSCoV-2传染性极强，医务人员感染率高达29%[1]。患者常规检测的临床样本（血、痰液、粪便及尿液等）可产生气溶胶，具有潜在致病性和高传染性。为了给临床提供快速、准确的诊疗依据，且能避免实验室人员感染，本文就SARS-CoV-2的病原学特点、临床实验室检测手段及临床实验室的生物安全防控措施作一综述。

1 SARS-CoV-2病原学特点及流行病学特征

SARS-CoV-2是直径为60～140 nm，且有包膜的β属冠状病毒，与非典型性肺炎病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus，SARS-CoV)及中东呼吸综合征病毒(Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus，MERS-CoV) 为同一属[2]。目前研究发现SARSCoV-2编码15种非结构蛋白（nsp1～nsp10、nsp12～nsp16）、4种结构蛋白（S、E、M和N）和8种辅助蛋白（3a、3b、p6、7a、7b、8b、9b和orf14），且这些编码蛋白的氨基酸序列上，与SARS-CoV之间存在差异性氨基酸位点，如编码的8b蛋白（121个氨基酸）的长度要长于SARS-CoV（84个氨基酸）[3]。有学者用冷冻电镜技术发现SARS-CoV-2的S蛋白对人体ACE2的亲和力高于SARS-CoV的S蛋白[4]，提示SARS-CoV-2与SARS-CoV在致病性、传染性和抵抗力等方面存在差异。SARS-CoV-2对紫外线和热敏感，56℃ 30 min以及脂溶剂（75%乙醇、含氯消毒剂、氯仿等，氯己定除外）均可有效灭活病毒[5]。人类为SARS-CoV-2易感宿主，在人际间除飞沫传播外，还存在粪-口传播、间接接触传播和气溶胶传播等多种传播途径[6]，传染性比SARS-CoV和MERS-CoV强[7]。COVID-19患者常出现发热、咳嗽和乏力的症状，严重时会导致呼吸系统功能衰竭，还可能引起消化系统、心血管系统以及泌尿系统的功能障碍[8]。

2 COVID-19实验室检测

2.1 血液检测

COVID-19患者白细胞总数正常或减少，淋巴细胞计数减少，C反应蛋白、血清淀粉样蛋白A升高[5]。中性粒细胞/淋巴细胞比值可用于评估COVID-19患者病情的进展程度，准确性较高，如COVID-19患者的中性粒细胞/淋巴细胞比值≥3.13，表明患者有较高重症的风险[9]。有研究结果显示，COVID-19患者外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞数量虽然都有明显减少，但状态均表现为过度活化，且CD8+T细胞有高毒性[10]。这是COVID-19患者免疫系统损伤的重要原因。

2.2 生化和免疫检测

COVID-19患者会出现肌酸激酶、乳酸脱氢酶、丙氨酸氨基转移酶以及天门冬氨酸氨基转移酶升高[5]，还会出现血清白蛋白水平降低、血浆血管紧张素Ⅱ水平升高，部分患者还出现尿蛋白水平升高[11-12]。有学者研究发现，COVID-19患者血浆中细胞因子（粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α等）水平明显升高[13]，表明SARS-CoV-2感染会引发细胞因子风暴。

2.3 凝血功能检测

有研究结果表明，COVID-19患者纤维蛋白原以及D-二聚体会升高；当COVID-19患者出现早期的弥散性血管内凝血时，D-二聚体可显著升高，伴有凝血酶原时间的轻度延长；当COVID-19患者出现显性的弥散性血管内凝血时，血小板计数会显著减少；COVID-19死亡病例中，患者血浆中的纤维蛋白降解产物也显著升高[13]。

2.4 病原学检查

2.4.1 SARS-CoV-2的核酸检测 目前，主要采用实时荧光定量聚合酶链反应（r e a ltime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）检测患者标本（鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液及粪便等）中是否含有SARS-CoV-2特异性的RNA序列，来对COVID-19进行早期病原学诊断[14]。但这一检测方法存在一定的假阴性，原因在于：（1）临床样本采集的部位与方法不同，导致SARS-CoV-2的载量过少，无法检测；（2）诊断试剂的可靠性及敏感性有限。为此，在检测之前，应做到以下2点：（1）对临床样本的质量进行评估，保证采集的临床样本病毒载量能在检测范围内；（2）验证试剂的性能，保证结果的精密度和符合性。

此外，目前还有纳米孔靶向测序（nanopore targeted sequencing，NTS）方法。该方法主要检测SARS-CoV-2的10 kb基因区域，增加捕获SARS-CoV-2核酸的概率，且可读出其基因序列，敏感性和准确性高于RT-qPCR。NTS可实现在4 h内准确检测SARS-CoV-2，且可检测SARSCoV-2基因组变异情况[15]。

2.4.2 SARS-CoV-2的特异性抗体检测 血清中的SARS-CoV-2特异性IgM和IgG抗体检测可用于筛查和辅助诊断COVID-19。IgM是COVID-19患者体内早期（发病3～5 d）出现的抗体，而IgG则是感染中、后期产生的抗体[5]，对COVID-19患者进行血清特异性IgM和IgG抗体检测，不仅可用于早期疑似病例筛查，还可以用于COVID-19患者的病程监测和回顾性诊断。特异性抗体检测也有其局限性，主要为：（1）产生抗体前存在窗口期；（2）抗体检测易受干扰，如患者血液中存在类风湿因子、非特异IgM或自身抗体等，会导致检测结果出现假阳性。

3 实验室生物安全防护

3.1 实验室环境生物安全防护

3.1.1 实验室分区 实验室须合理划分清洁区、缓冲区和污染区，避免交叉污染。须在生物安全二级以上的实验室内进行COVID-19患者的常规血液检测、体液检测以及SARS-CoV-2的核酸检测[6]。应注意的是：（1）血常规和C反应蛋白等检测建议采用闭管操作，病毒抗原或抗体筛查等开放性操作应在生物安全柜内进行；（2）实验室环境须符合分子生物学实验室基本要求，并获得有关部门批准后方可开展SARS-CoV-2的核酸检测工作；（3）若负压实验室出现正压时，实验室人员应紧急撤离。

3.1.2 实验室环境消毒 临床实验室需采用以下的消毒措施[16]：（1）实验室每天都要进行紫外线照射进行空气消毒，照射时间不短于30 min；（2）实验室每天需在试验前后使用1 000 mg/L有效氯消毒液对工作台面及地面进行消毒；（3）生物安全柜等金属设备和仪器采用75%乙醇进行消毒。

3.1.3 实验室生物安全操作失误或意外的防护处理 当临床样本出现溢洒时，应将实验室空间密闭，防止污染物扩散；采用5 500 mg/L有效氯消毒液的毛巾覆盖污染区30 min后进行擦拭消毒[17]，消毒液必须现配现用，有效期为1 d。

3.2 实验室人员生物安全防护

需要接触SARS-CoV-2标本的实验室人员应实施生物二级以上的个人防护[16]。

实验室人员防护用品穿戴顺序为：在非发热门诊等常规检验区域执行手卫生，戴帽子、医用外科口罩/医用防护口罩和手套；在发热门诊实验室和PCR实验室等进行SARS-CoV-2检验的高风险区域需戴护目镜/防护面罩（屏），穿隔离衣和穿防护鞋套（靴），戴橡胶手套。

实验室人员防护用品脱顺序为：在污染区脱手套、脱隔离衣、脱防护鞋套（靴）、脱防护面罩/护目镜。注意事项：（1）执行每一步动作后需执行手卫生；（2）脱防护服前，可用500 mg/L有效氯消毒剂进行全身喷雾消毒；（3）防护面罩与护目镜须75%乙醇浸泡消毒后方可重复使用。在缓冲区脱口罩、帽子后执行手卫生，方可进入清洁区。

3.3 临床样本处理

3.3.1 检验前的样本处理 检验前对临床样本的处理需采用以下防护措施[18-19]：（1）标本采集。采集者须按照三级生物安全防护，且在采集过程中要做到尽量减少接触患者皮肤、衣服、用品等；避开患者咳嗽的时刻，避免飞沫传播；尽量缩短在床旁的持续时间。（2）样本转运。COVID-19患者的临床样本需专人运输，运输者须采用二级生物安全防护，需采用具有3层包装的专用运输系统，包括SARS-CoV-2专用转运箱、样本盒和有生物安全标识的密封袋，标本采集后，将临床样本装入密封袋，置于样本盒中，再放入转运箱。运输时间不超过2 h。运输期间保持转运箱平稳。若运输发生意外，须到接收地点与接收者共同处理。（3）样本接收与处理。接收、分拣、离心疑似或确诊患者临床样本时，实验室人员须采用二级生物安全防护。交接环节需有记录，以便溯源。开启转运箱取样本前，应使用75%乙醇喷雾消毒转运箱；从密封袋取出样本后，应用紫外灯或75%乙醇对样本及转运箱、样本盒进行消毒。样本离心后静置10 min方可取出。若离心时临床样本出现洒漏时，实验室人员须按照三级生物安全防护，需立即停止离心，静置30 min以上后进行75%乙醇喷雾消毒处理方可取出标本，并使用75%乙醇擦拭（喷淋）消毒离心机。

3.3.2 检验中的样本处理 检验中对临床样本的处理需采用以下防护措施[6，19]：（1）血常规由闭管的全自动仪器检测，执行此操作的实验室人员须采用二级生物安全防护。若需涂片镜检，实验室人员须按照三级生物安全防护在生物安全柜内操作，涂片完成后须紫外照射30 min后再取出阅片。阅片完成后，应将玻片置于5 500 mg/L含氯消毒液的锐器盒中。（2）生化、免疫与凝血功能检测需开盖检测。应在生物安全柜内完成开盖后，用专用箱运输至全自动仪器检测。执行此操作的实验室人员须采用三级生物安全防护。生物安全柜操作前后需开启风机运行5 min。（3）SARS-CoV-2的核酸检测：样本进行核酸扩增前需对临床样本进行病毒灭活（56℃孵育30 min后加入蛋白酶K或试剂盒自带的核酸提取裂解液）。执行此操作的实验室人员须采用三级生物安全防护。

3.3.3 检验后样本处理 检验后对临床样本的处理需采用以下防护措施[6]：（1）检验报告建议无纸化，若需要纸质报告，须有效消毒才出检验科。（2）开盖的临床样本检测完后须在生物安全柜中重新盖上新的管帽密封，置于有生物危害标识的双层医用垃圾包装袋（黄色）中密封放置。（3）所有的临床标本，包括密闭试管和开盖的试剂盒，均需要采用高压灭菌。

4 废弃物处理

4.1 废液的处理

对于检验过程中产生的感染性废液，需用10 000 mg/L有效氯消毒剂进行消毒处理，且需验证消毒效果，确保感染源被彻底灭活[20]。

4.2 固体废物的处理

对于实验过程中产生的固体废物（如检验后的临床样本、耗材和个人防护装备等）须使用双层标注“新型冠状病毒感染的肺炎”的包装袋包装，采用鹅颈结式分层封口，经高压灭菌后，集中将其通过废弃物通道送至固体医疗废弃处理单位处置[21]。

4.3 建立废弃物处理记录

定期监测处理后的污水及压力蒸汽灭菌效果，并如实填写所有“新型冠状病毒感染的肺炎”标本的处理记录，且此资料保存3年[21]。

5 总结

及时发现、早期诊断和快速干预对于挽救COVID-19患者的生命至关重要。快速、准确的实验室检测可以为COVID-19的诊疗提供重要的依据。目前临床上用于COVID-19患者诊断的重要的实验室检查有血液检测、生化及免疫检测和病原学检查。其中病原学检查，包括SARSCoV-2特异性抗体和核酸检测为COVID-19确诊提供了病原学依据。由于这些临床样本具有潜在的致病性和传染性，故实验室人员在检验操作的全过程中，应采用必要的实验室生物安全防护措施，避免在检验过程中交叉感染，而且要防止临床样本中可能含有的病原体对外界环境的污染。