溃疡性结肠炎的动物模型研究进展

石 磊，李军祥，史 瑞，王志斌，余轶群，毛堂友，路琼琼，孙中美，韩 啸，郝 钰

溃疡性结肠炎(ulecerative colitis, UC)和克罗恩病(Crohn's disease, CD)是炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)中最常见的疾病。UC是发生在结直肠、原因尚不明确的慢性非特异性炎症性疾病，本病好发于中青年，腹泻、黏液脓血便、腹痛等症状严重影响患者生活质量。其发病复杂，涉及遗传、免疫、菌群等多个方面，因本病难治愈、易复发、癌变风险高、往往需要终生服药，世界卫生组织将其列为现代难治病之一。因此，开展UC的发病和药效学研究就显得非常有意义。为更好地开展针对UC的临床前研究、药效观察或发病学研究，动物模型成为研究过程中不可或缺的手段。虽然UC与CD涉及的发病机制不同，但二者在临床表现中有很大的相似之处。因此，很大一部分实验仍然直接以传统的方法建立IBD模型，并没有科学区分UC与CD模型，这也就直接影响了研究结论的可靠性。

根据UC动物模型建立的方法不同，可以归纳为化学性、免疫和基因修饰性两大类，通过不同方法建立的UC动物模型，也有其更加适合的研究意义和归属。因此，本文主要对近年来不同的UC动物模型及其侧重点进行综述，以期对UC的动物实验提供思路。

1 化学性模型

1.1葡聚糖硫酸钠模型 葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium, DSS)模型最初由Okayasu等[1]科学家所报道，由于DSS化学诱导结肠炎症导致的肠上皮形态损伤和症状类似于UC在人体中的表现，因此，这种简单而可重复性的动物模型被广泛应用于UC的基础研究，也是使用最多的方法[2]。DSS是一种水溶性、带有负电荷的硫酸化多糖，分子量从5～1400 kDa不等，向饮用水中添加40～50 kDa的DSS就能导致小鼠结肠炎症的发生。在DSS模型中，硫酸化多糖不会直接诱导肠道炎症，而是作为结肠上皮的直接化学毒素，引起肠上皮细胞损伤和黏膜层的破坏，导致肠腔内细菌、其他抗原和促炎物质进入黏膜或黏膜下层，从而引发炎症反应[3]。

文献证实，包括UC在内的IBD，其肠屏障的功能障碍主要体现在紧密连接的表达变化，以及在炎症状态下，黏膜的黏附性下降[4]。DSS主要通过破坏IEC之间的紧密连接结构、减少黏蛋白数量，并影响黏液层、打破固有菌群的分布影响微菌群数量[5-6]，从多方面破坏肠屏障并提高肠屏障的通透性，使有害的大分子物质等可以顺利通过肠屏障或发生菌群易位，这种病理性的定植、侵入会刺激先天和适应性免疫应答，以及促炎细胞因子和趋化因子的分泌，还能导致具有细胞毒性潜力的细胞的侵入，如中性粒细胞和炎性巨噬细胞。

DSS诱导的结肠炎症是否有效依赖于以下因素，包括DSS浓度(通常为1%～5%)、给药的持续时间和频率(建立急性或慢性)、DSS的分子量、动物的适应性(C3H/HeJ、C57BL/6和BALB/c小鼠品系更易感)和动物本身或饲养条件的微生物环境[7]，根据上述因素的不同，可以建立包括不同时期、不同活动度的动物模型。

DSS模型可主要用于研究肠炎诱导过程中的先天免疫机制，包括Toll样受体(Toll like receptor, TLR)、C型凝集素受体或炎性小体等刺激[8]。有研究发现，TLR2-/-、TLR4-/-和髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)-/-等基因缺失鼠，在DSS模型中，通过影响TLR信号通路，表现出UC病程的恶化，原因可能是依赖于这些先天免疫信号的肠上皮细胞和巨噬细胞中的信号通路，能够促进肠上皮增殖、肠屏障重建、限制细菌移位及局限炎症，而肠上皮的破坏会使先天免疫功能遭到一定程度的损伤[9]。该模型另一种重要用途就是在上皮重建过程中，涉及多种信号通路的相互作用和长期结肠炎症导致结肠癌的相关机制研究[10-11]。有研究证实，缺乏由肠上皮特异性产生NLRP6的小鼠，在DSS模型中会表现出更严重的病情，可能由于NLRP6可通过调控隐窝中Prevotellaceae菌的生长从而影响白介素-18(interleukin-18, IL-18)的分泌[12]。因此，DSS模型还可用于肠道菌群在结肠炎发生发展中的作用研究。

DSS模型由于多采用自由饮用的方式，每只动物的饮用量无法精确操控，可能出现研究偏倚，可能对结果造成一定的影响。有条件的实验室团队，可以采用单笼饲养以尽量保证每只动物的饮用量。如果采用群养的方法，预先准备的DSS溶液一定要保证每日都能有剩余，减少因竞争饮水引起的给药量不足。

1.22,4,6-三硝基苯磺酸模型 该模型的建立多采用2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS)联合不同浓度乙醇的方法，使结肠黏膜遭到不同浓度乙醇刺激灼伤后，黏液层被溶解、破坏，损伤了肠上皮细胞和肠屏障功能，继而使TNBS进入黏膜内与构成组织蛋白的赖氨酸ε-氨基团结合，作为完全抗原引起黏膜的免疫反应，进而引起级联式的免疫应答[13]。在大鼠体内，有文献采用10 mg TNBS溶于0.25 ml的50%乙醇，在距离肛门约8 cm处滴注灌肠[14]；也有采用0.6 ml终浓度为33.3%的TNBS/无水乙醇混合溶液进行灌肠的方法[15]。小鼠则采用200 mg/kg TNBS溶于30%乙醇，在距肛门3～4 cm处灌肠的方法建立模型[16]。

TNBS模型主要引起以Th1介导的免疫反应，表现为黏膜固有层CD4+ T细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的浸润增多，可出现严重的腹泻甚至直肠脱垂。另有研究发现，TNBS应用于SJL/J或C57BL/10小鼠，可引起透壁性结肠炎，表现更接近于CD[17]。也有研究指出，TNBS模型以Th1/Th17占主导的免疫失衡为主[18]。因此该模型更适用于研究依赖于CD4+ T细胞免疫功能的肠道炎症反应。此外，还有研究发现，在BALB/c小鼠中，慢性TNBS肠炎模型特征是黏膜固有层的持续性纤维化，因此认为这种TNBS慢性模型是一种针对人类IBD出现肠道纤维化潜在病理机制研究的适合工具[19]。

1.3恶唑酮模型 恶唑酮(oxazolone, OXZ)是染料、农药等化学物质的重要中间体，同时也是一种经典的半抗原。将其作用于动物身体的各个部位，均可诱发接触性过敏反应[20]。研究表明，OXZ模型是由IL-4过量引发的Th2型炎症，其组织学变化特征符合人类的UC表现[21]。有研究发现，OXZ在小鼠直肠内给药后，能造成严重的结肠炎模型，表现出远端结肠黏膜和黏膜下层的急性炎症，并伴有溃疡和固有层隐窝内中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞的浸润[22]。SJL/J和C57BL/10小鼠对OXZ高度敏感，但C57BL/10小鼠对其又有较强的抵抗力，在该品种小鼠身上建立OXZ模型前，往往需要进行皮肤OXZ的预致敏操作[23]。

OXZ模型与其他IBD模型相比，更加接近UC表现，其病理特征除上述组织学改变外，还体现在远端结肠的炎症反应、2型和9型细胞因子(IL-4、IL-5、IL-9和IL-13)的分泌增加，固有层内T细胞表现也与人类UC中观察到的特征相类似[24]。有研究指出，在CD1d抗原递呈激活了自然杀伤T细胞(natural killer T cells，NKT)后[25]，NKT分泌的IL-13为疾病的重要触发因素，在向T细胞、B细胞和T细胞产生IL-9信号转导过程中，IL-4R起了关键性的作用[26]。因此，OXZ模型更适合用于研究肠道炎症过程中2型、9型细胞因子相关的免疫反应。此外，小剂量的OXZ可以引起混合型的Th1/Th2免疫反应，这也提示研究者，OXZ在不同品系动物身上建立模型，需要根据研究目的的不同，自行摸索最佳合适的剂量。反复接受OXZ刺激，BALB/c小鼠可发展为慢性结肠炎，这种慢性肠炎模型与人类慢性UC比较接近，可用于慢性UC中的相关机制研究[23]。

模型建立的推荐方法包括：①大鼠：用300 μl含5% OXZ的无水乙醇对腹部皮肤进行预致敏，在致敏后的第5天和第7天，行直肠内灌肠给药，药量为450 μl含5% OXZ的50%乙醇溶液。②小鼠：用50～150 μl含3% OXZ的无水乙醇对腹部皮肤进行预致敏，在致敏后的5～8 d，行直肠内灌肠给药，药量为70～150 μl含0.75%～1% OXZ的45%～50%乙醇溶液[2]。

1.4乙酸模型 乙酸是另一种较常使用、容易诱导结肠炎的化学物质。该模型通过乙酸的直接刺激作用使结肠IEC凋亡增加，黏膜屏障遭到破坏，从而使炎症介质大量释放，诱导炎症发生[27]。有研究认为，乙酸模型与人类的IBD在病理学表现、发病机制和炎症介质的表达分泌均较为相似，可以较好地模拟IBD发病[28]。研究发现，直肠内给予稀释后的乙酸溶液可以引起黏膜的非透壁炎症，其特征是肠黏膜内中性粒细胞浸润增加，黏膜和黏膜下层的大范围坏死，血管扩张，水肿和黏膜下的浅溃疡，而这些表现与人类UC有非常相似的特征[29]。有学者认为，乙酸模型是利用乙酸对IEC的直接刺激作用，引起结肠部位出现急性化学损伤，不能确切地反映人类UC发病过程的免疫学变化，故而不适合免疫发病机制的相关研究[30]。但另有学者认为，乙酸模型在最初24 h内上皮损伤性质上不是免疫学导致的，因此如果设计针对免疫反应的药物，应当在成功诱导模型24 h后进行[31]。

在乙酸模型中，乙酸以质子化形式进入细胞内，可能导致细胞内酸化，导致更进一步的上皮细胞损伤。氧化应激很可能在IBD的发生和发展中起着重要作用[32]。由于在IBD患者中发现高水平的超氧离子、过氧化氢、次氯酸、羟自由基以及含氮的活性氧，提示氧化应激是IBD中的关键致病因素[33]。同样，在使用乙酸诱导结肠炎的动物模型中，也有氧化和抗氧化物质之间的不平衡特征出现[34]。有文献证明，中性粒细胞的浸润导致超氧离子的产生并引发级联反应产生氧活性物质，这些氧活性物质对于组织坏死和黏膜功能障碍的进展具有促进作用[35]。值得注意的是，乙酸模型存在一定的自愈性，不适合进行慢性模型的建立。

1.5角叉菜胶模型 角叉菜胶是从红藻中分离获得的高分子硫酸化多糖。基于硫酸化程度和溶解度的不同，可以被分为κ、ι和λ三种不同的亚型。角叉菜胶本身对IEC没有直接损伤作用，但水解后的产物会引起包括豚鼠在内的多种动物(兔、大鼠、小鼠)发生结肠溃疡[2]。很早就有研究指出，当在豚鼠饮用水中添加降解的角叉菜胶时，30 d后豚鼠大肠中100%会出现溃疡[36]。λ-角叉菜胶诱导的IBD大鼠模型，随着时间的推移，其肠道的组织病理学和大体病变都逐渐与人类UC的表现相吻合[37]。

角叉菜胶在动物模型中诱导炎症的具体机制尚不清楚，但已证明角叉菜胶可减少结肠中上皮糖蛋白的数量，并能抑制巨噬细胞和淋巴细胞之间的相互作用[38]。使用TLR4-和MyD88-缺陷小鼠证实了TLR4和IL-6参与了对角叉菜胶的先天免疫反应[39]。有研究在TNBS的BALB/c小鼠结肠炎模型中发现，用角叉菜胶预处理加重了TNBS结肠炎的严重程度(包括症状和组织学)，同时伴随着IL-6和肿瘤坏死因子-α的表达增加和IL-10的减少[40]。通过这些动物研究已经得出这样的假设，角叉菜胶可以作为条件性炎症剂，放大由病原体引起的任何现有的肠道慢性炎症[41]。

此外，近年来多项研究发现，角叉菜胶模型可更好的用于肠道微生物的相关机制研究。用角叉菜胶和甲硝唑同时干预常规豚鼠，已被证明可以预防溃疡的发展[42]。另有研究发现，使用角叉菜胶之前用B.vulgatus菌免疫的动物比单独使用角叉菜胶的动物，将会更快发展为实验性结肠炎，且病情更为严重[43]。目前，角叉菜胶的动物模型以豚鼠居多，饲养成本较高。

2 免疫与基因修饰模型

2.1CD4+ CD45RBHighT细胞移植模型 IBD的最佳表征模型之一就是CD4+ CD45RBHighT细胞移植建立的小鼠慢性结肠炎模型[44]，这一模型的发现使小鼠肠道炎症的发展研究向前迈出了重要的一步。其核心原理是采用细胞分选技术从供体小鼠的脾脏中分离高浓度的CD4+ CD45RBHighT细胞，移植到同基因型的免疫缺陷SCID或RAG-1-/-小鼠体内，5～10周后即可引起受体小鼠出现消耗性疾病表现和结肠的弥漫炎症，发病时间快慢和程度取决于当地动物饲养条件中的菌群分布情况[45]。刘占举[46]从SCID小鼠脾脏磁珠分离CD4+ CD45RBHighT细胞并移植给同基因型的SCID小鼠，结果发现3～5周小鼠开始出现体重下降、6～8周出现慢性结肠炎表现，如腹泻、便血等，组织学表现为大量淋巴细胞浸润、黏液层破坏、IEC丢失、隐窝脓肿等，但炎症细胞浸润程度不够确定，有时炎症可发生在整个黏膜层并伴有肉芽肿形成，因此本方法建立的结肠炎模型有时可能会更偏向CD。

研究发现主要产生IL-10的调节性T细胞，与致病性CD4+ CD45RBHighT细胞一起移植时，作为重组IL-10或转化生长因子-β的全身给药，可以预防肠道炎症和抗原特异性免疫应答的发生，因此学者认为IL-10和转化生长因子-β是该模型中的抗炎因子[47]。

2.2IL-10基因敲除模型 IL-10是Th1细胞抑制因子，也是巨噬细胞的效应因子。体外研究已经表明，IL-10能抑制IL-12和肿瘤坏死因子-α的产生，抑制共刺激分子B.7.1和B.7.2表达，抑制T细胞增殖，并能促进抗原特异性调节性T细胞形成[48]。靶向缺失IL-10基因的小鼠，能够自发形成慢性结肠炎模型，形成以Th1免疫应答为主的炎症反应，同时组织学上，肠黏膜中可伴有大量淋巴细胞的浸润、巨噬细胞和中性粒细胞的活化[49]。该模型主要用于研究以Th1反应为主的T细胞免疫机制或炎性因子的作用环节，但该方法建立的模型更趋向于CD。

有研究发现，IL-10敲除模型在无菌环境下，不会形成结肠炎，而小鼠从无菌环境转入普通或有菌环境，随着环境中菌群的种类数量不同，引发的结肠炎程度不一致，这可能与结肠单核吞噬细胞中的MyD88缺乏有关[50]，因此有学者认为，IL-10缺失的模型对肠道菌群的研究更为有利。

2.3信号转导与转录激活因子3基因敲除模型 小鼠巨噬细胞和中性粒细胞中信号转导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)的特异性敲除，会导致小鼠自发性的小肠、结肠炎，模型组织学表现可见透壁病变，以及结直肠癌的高发病率[51]。其机制可能与缺乏STAT3的巨噬细胞，在肠腔内食物或菌群抗原的刺激作用下引起的炎症反应有关。

与STAT3密切相关的还有IL-22，二者共同构成IL-22/STAT3信号通路，急性结肠炎产生的IL-22可以介导STAT3促进上皮细胞修复的功能[52]。有研究发现，在缓解期UC肠黏膜中，细胞因子信号抑制蛋白-3可以反向抑制STAT3的表达，从而抑制IL-22/STAT3信号通路，阻碍肠上皮修复，使UC增加复发的可能性[53]，因此该研究反证了STAT3敲除对肠上皮损伤从而导致结肠炎的间接影响。

2.4A20基因敲除模型 A20是一种泛素编辑分子，可抑制肿瘤坏死因子诱导的核因子-κB活性。在A20敲除的缺陷型小鼠中，由于A20缺陷，未能及时终止肿瘤坏死因子诱导的核因子-κB反应，导致自发性结肠炎和肿瘤性疾病的发生[45]。有学者通过将小鼠树突细胞(dendritic cell, DC)中A20和上游的接头分子MyD88特异性敲除，证实了A20可以同时抑制依赖于MyD88和不依赖MyD88的信号通路，分别导致T细胞亚群的扩增以及T细胞和DC的激活。且敲除A20的小鼠DC，可自发性的成为淋巴细胞依赖的结肠炎，并表现出血清阴性的强直性脊柱炎，与人类IBD，特别是UC的肠外表现比较接近[54]。

2.5多重耐药1a基因敲除模型 啮齿类动物的多重耐药(multidrug resistance, MDR)基因主要有1a、1b和2三种基因型，MDR1a敲除的基因缺陷鼠，在菌群诱导下可发展成为自发性肠炎。人类的MDR基因位于第7号染色体(q21.1)上，能够编码P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)，同时也是IBD的易感位点。有研究发现，MDR1a缺陷鼠的发病可能与IEC破坏有关，而与淋巴细胞功能关系并不大，且该模型导致的P-gp表达和功能下降，与临床中UC患者的特点相一致，因此认为该模型可能更适合开展结肠炎中P-gp的相关研究[55]。

2.6IL-7转基因模型 IL-7是致病性CD4+的效应和记忆T细胞关键存活因子，致病性CD4+效应和T细胞主要存在于骨髓中，因此骨髓是IL-7主要来源。IL-7的转基因模型小鼠，体内过表达IL-7，导致以Th1反应为主的自发性慢性结肠炎，其组织学表现与人类UC比较接近[56]。最新研究发现，N6-甲基腺苷能通过调控IL-7信号通路，维持T细胞稳态从而缓解结肠炎，也证明了IL-7在结肠炎中的致病性作用[57]。

综上所述，随着越来越复杂的IBD模型的出现，研究人员可以根据每种模型不同的特点和优势选择合适的动物模型去研究具体问题。虽然目前仍没有某种单一的动物模型可以概括人类UC所有的致病原因和临床特征，但不同模型的不同侧重，有助于揭示UC的发病或加重机制。由于多数基因修饰的自发模型，其发病和严重程度在很大程度上取决于环境因素，导致研究存在较高的可变性。化学性方法诱导的急慢性UC模型，因其成本低、可控性和可重复性强，虽然只能反映UC的某个方面，但仍然是目前UC研究中最常用的方法。