SSR 技术在果树上的应用

罗 球 张庆祥

（江西省抚州市临川区茅排乡政府，江西抚州 344100）

简单重复序列（SSR）是由几个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列，这些序列具有保守性，在生物基因组中大量存在。大量实践结果表明，SSR 更容易被检测出来，在果树研究方面得到了广泛应用[1-2]。

1 SSR 技术的概述

1.1 技术原理 对于SSR 两端的序列来说，普遍为保守程度较高的单拷贝序列，基于此能够完成一对特异引物的构建，以此完成SSR-PCR，并实现串联重复序列的扩增。在电泳的支持下检测扩增段的多态性现象，即实现SSR 标记。在当前的分析中，一般使用串联重复数的差异性完成相应的遗传分析，并实现对微卫星DNA 长度多态性的显现。

1.2 技术特点 对于SSR 技术来说，其在实际的应用中主要表现出以下特点。①SSR 的数量很多，普遍可以覆盖整个染色体组。②具有明显的多等位基因特性，因此富含的信息量更多。③在使用中遵循孟德尔遗传定律，呈现出共显性的特征。④在实际的使用中对DNA 数量以及纯度的要求较低，更容易实现PCR 分析，且分析结果具备更优的重复性。⑤引物序列的顺序完成，为实现交换提供更好的支持。

1.3 技术优势

1.3.1 SSR 技术与RFLP 标记技术 RFLP 标记技术是发展最早的DNA 标记技术，在使用中需要利用限制性内切酶酶切DNA，并使用放射性标记的探针杂交显示特定的DNA 片段。相较于RFLP 技术来说，SSR 技术在实际应用中的操作流程更为简单，且分析速度更快、多态性更强，同时可以完成基因组串联重复序列的检测，这是RFLP 技术无法实现的，因此SSR 技术有着更高的应用价值。

1.3.2 SSR 技术与RAPD 技术 RAPD 技术是建立在PCR基础上的一种分析技术，能够实现整个未知序列的基因组进行多态性分析。相较于RAPD 技术来说，SSR 技术在实际应用中具有更强的重复性与稳定性，在分析结果的比较中发挥出了更好的作用。

总体而言，SSR 技术包含RFLP 技术以及RAPD 技术的优势，且可在较短时间内完成大规模的样本分析，实用性更强，能够弥补后两种技术的不足，因此有着更广阔的应用前景。

2 SSR 技术的应用步骤分析

在实际的应用中，SSR 标记的分析步骤可以总结为两步，即微卫星引物的获取与设计、SSR-PCR 扩增与检测。

2.1 微卫星引物的获取与设计 该步骤可以进一步细化为获取引物、使用近缘种引物、引物设计3 个环节。其中，在获取引物中，可以提取所研究对象的已知SSR 两翼序列/引物，或者在公共DNA 序列数据库中提取。对于使用近缘种引物来说，由于属内种间和SSR 位点序列基本保守，因此有着较高的可行性。在引物设计中，可以依托同一物种间微卫星两侧序列的保守程度高这一规律完成，从而达到同一物种（甚至可以为不同物种）其他基因型微卫星片段的扩增。在此环节中，需要构建基因组DNA 文库。

2.2 SSR-PCR 扩增与检测 在SSR 技术的应用中，因为使用了特异性扩增，所以扩增的稳定性更好。需要注意的是，在不同引物中，（G+C）%含量存在一定的差异，且扩增产物的长度也有所不同，所以应当针对所有引物设定扩条件。同时，处于对结果明显性、准确性的考量，必须使用具备加高分辨率的聚丙酰胺凝胶电泳，并在实际扩增过程中投入包含放射性标记的dNTP，以确保显示结果的质量。

3 SSR 技术在果树上的应用

3.1 在果树种质资源研究方面的应用 从当前的情况来看，在果树种质资源研究方面，SSR 技术主要被应用于鉴别品种真实性上，以此达到避免遗传漂变、外来划分授粉等问题的效果。同时，SSR 技术还被应用于研究个体与群体之间的近缘程度，实现个体遗传构成的分析，并对群体内的变异进行区分。例如，使用SSR 技术展开多个葡萄品种、品系的鉴定，能够辨别出其中具备相同扩增片段的品种，并将其与其他品种进行区别。在SSR 技术的支持下，还可以实现酿酒葡萄品种品本的鉴定。当前，在柑橘珠心苗的研究中，SSR 技术被应用在种质鉴定方面，并取得了一定的成效。总体来说，SSR 技术在种质资源的收集、保存、评价与利用中均发挥了极高的应用价值。

在核果类果树种质资源的遗传分析中，SSR 技术的应用为种质资源研究及品种鉴定提供了技术支持，从这一角度来说，在农艺性状标记方面，SSR 技术能够充分发挥作用。使用SSR 技术分析桃种间的亲缘关系能够发现，部分桃种间存在亲缘关系，例如新疆桃与普通桃、甘肃桃与陕西桃等。在此基础上，还可以获取桃间的演化模式，为分子标记辅助育种在桃栽植方面的有效应用提供支持。

对于SSR 技术来说，其还可以应用于跨种、跨属的种质资源研究。例如，利用SSR 技术可以明确柿属植物分子进化以及系统发育的相关内容；利用SSR 技术分析果梅种质资源的遗传多样性，可以明确PCR 反应体系的主要成分，结合对已知微卫星序列展开同源性分析以及抗寒性鉴定（性能鉴定），能够完成优质梅种质的筛选。

3.2 在构建分子标记遗传图谱方面的应用 在当前技术水平条件下，分子标记遗传图谱的主要构建技术为SSR 技术。对于果树来说，其杂合程度较高、生长周期更长，且部分果树存在孤雌生殖的特点，因此利用构建分子标记遗传图谱完成标记、定位、克隆经济形状具有极高的现实价值。目前，世界范围内已经完成了超过500 个由SSR 标记构成的水稻分子连锁图，平均长度达到3.6 cm。

目前，农业的迅速发展使得果树研究成果频出，构建果树分子标记遗传图谱的速度也越来越快。在当前的研究中，已经构建樱桃、李子、桃等多种果树种的遗传连锁图谱，其中，普遍使用了SSR 技术进行辅助标记，核心技术为RFLP 技术。例如，依托存在于柑橘基因组文库中的多对SSR 引物，补充已知柑橘遗传图谱（构建方法为同工酶方法与RFLP 技术），实现了2 个连锁图的新增，其中包含8 个标记。在构建葡萄遗传连锁图的过程中，应用SSR 技术以及CAPS，可以得出某SSR 分子标记与性别基因呈现出相对紧密的连锁状态，结合QTL 定位法能够进一步获得与抗病基因保持连锁状态的分子标记，为葡萄品种及其优化提供支持。

4 结语

相比于RFLP 标记技术以及RAPD 技术，SSR 技术拥有两者的优势，能够弥补后两种技术的不足，且可在较短时间内完成大规模的样本分析，实用性更强，因此拥有更为广阔的应用前景。在当前的果树研究中，SSR 技术主要被应用在果树种质资源研究方面以及构建分子标记遗传图谱方面，且取得了很多研究成果，值得重点关注与探究。