LED光谱对红鳍东方鲀仔稚鱼形态性状及生长相关基因表达的影响*

魏平平 李 鑫 张俊鹏 费 凡 马 贺 高东奎 宋昌斌 陈 涛 刘 鹰

LED光谱对红鳍东方鲀仔稚鱼形态性状及生长相关基因表达的影响*

魏平平1,3李 鑫1,3张俊鹏1,3费 凡1,3马 贺1,3高东奎1,3宋昌斌4陈 涛5刘 鹰1,2,3①

(1. 大连海洋大学 大连 116023; 2. 青岛海洋科学与技术试点国家实验室 青岛 266000; 3. 辽宁省水产设施养殖与装备工程研究中心 大连 116023; 4. 中国科学院半导体研究所 北京 100083; 5. 深圳市超频三科技股份有限公司 深圳 518000)

设置4种LED光谱环境，分别为蓝(450 nm)、绿(525 nm)、黄(590 nm)和白(400~780n m)，水温控制在(22±1)℃，光周期为16L:8D，光强设为200 mW/m2。研究光谱对红鳍东方鲀()受精卵孵化和孵化后1~18 d (即实验第6~23天)仔稚鱼形态性状(全长、体长、躯干长、尾长、头长、眼径和体高)以及生长相关基因，包括生长激素()、生长激素受体1型()、类胰岛素生长因子1型()基因相对表达量的影响。结果显示，蓝、绿、黄光处理组的受精卵比白光处理组早2 d孵化；在实验结束时，蓝光处理组中，仔稚鱼的全长、体长、躯干长和尾长生长最快，黄光处理组中，头长、眼径和体高生长最快。对于生长相关基因，蓝光下的基因表达量显著高于黄、白光组(0.05)，但与绿光组无显著性差异；不同光谱下，基因的表达量无显著性差异。结果表明，蓝光、绿光和黄光促进红鳍东方鲀受精卵的孵化，蓝光有利于红鳍东方鲀仔稚鱼的生长发育。本文研究了不同光谱对红鳍东方鲀仔稚鱼早期发育的形态性状及生长相关基因表达的影响，为养殖厂对红鳍东方鲀育苗提供科学的参考依据。

LED光谱；红鳍东方鲀仔稚鱼；形态性状；生长相关基因的表达

光(光周期、光强、光谱)作为重要的环境因子之一，对许多重要硬骨鱼类的胚胎发育、孵化和摄食有重要影响，包括奇努克三文鱼()和比目鱼() (Dey, 1990; Helvik, 1993、2010; Mangor- Jensen, 1995)等。在自然海域中，光随海水的深度增加而快速衰减，光谱成分也发生了极大的改变，红色光谱在浅水域占优势，而蓝色光谱能量较高，在深水域占据主导地位(Tyler, 1968)。随着光电材料科技的发展，发光二极管(LED)在水产中逐步开始应用，相比于传统的灯具，LED灯具有发光效率高、耗电量少、安全环保无污染等优点。但LED的一些光特性(光强、光谱、光周期)对硬骨鱼类的生长、摄食、繁殖的影响还知之甚少(Villamizar, 2009)。已有一些研究表明，光影响水产鱼类受精卵孵化、存活和生长发育(Puvanendran, 2002; Yoseda, 2008)。另外，不适宜的光强或光谱对硬骨鱼类的早期发育产生影响，导致骨骼发育不全、游泳能力丧失(Battaglene, 1990; Trotter, 2003)。因此，研究光对硬骨鱼类的影响可为养殖业提供科学的参考依据。

红鳍东方鲀()是亚洲地区(韩国、日本和中国)的重要养殖经济鱼种。目前，有关光谱对红鳍东方鲀仔稚鱼生长影响的研究甚少，本研究探究LED光谱对红鳍东方鲀仔稚鱼形态性状及生长相关基因表达量的影响，为养殖厂对红鳍东方鲀育苗提供科学的参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用卵取自河北天正实业有限公司人工饲养亲鱼的自然产卵，产卵当日，受精卵空运至大连海洋大学水产设施养殖与装备工程研究中心，放置于实验系统中立即进行光照实验。

1.2 实验方法

实验于2018年3月16日开始，采用遮光布遮挡自然光，采用4种LED光谱灯(深圳市超频三科技股份有限公司)，分别为蓝(450 nm)、绿(525 nm)、 黄(590 nm)、白(400~780 nm)，每种光谱设置2个平行，养殖桶采用圆型桶(直径为80 cm，水深为60 cm)，水体约250 L(10粒卵/L)，水温为(22±1)℃，光周期为16L:8D，光强为200 mW/m2，每天08:30采用SRI-2000-UV光谱照度计(尚泽股份有限公司)于水面5 cm处测定并校准。实验第6天，受精卵开始孵化，孵化后的仔鱼开口后，按生长期分别投喂轮虫()(约10个/ml)、卤虫()(约5个/ml)，从受精卵孵化出仔鱼开始取样，在实验第6、7、8、9、12、13、14、15、18、21、23天的09:00取样，每次随机取15~20尾，用戊二醛保存，采用9SMZ 745T/ SMZ1000高级体视显微镜[尼康映像仪器销售(中国)有限公司]测量全长、体长、躯干长、尾长、头长、眼径和体高。在实验第23天，每个处理组取30尾仔稚鱼保存于–80℃冰箱，用于测定生长相关基因的相对表达量。

1.3 总RNA的提取和生长相关基因表达量的测定

将冻存样品取出后，按照UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒(BBI, A606695)的操作说明书进行总RNA的提取。利用微量分光光度计(SMA4000, Merinton)测定RNA样品的OD260及OD280值，根据OD260/OD280的比值判断总RNA纯度；1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。

表1 定量PCR引物序列

Tab.1 Primer sequence for real-time quantitative PCR

1.4 数据分析

所有数据均以平均值±标准误(Mean±SE)表示，使用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析(One- way ANOVA)和LSD来检验不同处理组间基因表达量的差异，<0.05为差异显著，分析所得数据使用Origin 2017软件进行绘图。

2 结果

2.1 光谱对红鳍东方鲀受精卵孵化的影响

从实验结果得知，在实验第6天，蓝、绿、黄光处理组的受精卵开始孵化，白光处理组的受精卵在第8天开始孵化(表2)。白光处理组的受精卵与其他光色相比，孵化出仔鱼延缓了2 d。

2.2 光谱对红鳍东方鲀仔稚鱼形态性状的影响

在孵化后第6、7天，不同光谱下初孵仔稚鱼全长未出现显著性差异，但蓝光组仔稚鱼全长平均值高于绿、黄光组。在随后的生长过程中，白光组仔稚鱼全长始终低于其他光照组。在第17天，黄光组仔稚鱼全长显著高于蓝、白光组(0.05)，但蓝光组出现快速生长，在第20天，蓝、黄光处理组仔稚鱼的全长显著高于绿、白光组(0.05)，在第23天，各处理组之间无显著性差异，但蓝光处理组仔稚鱼的全长最大。

表2 光谱对红鳍东方鲀仔稚鱼全长的影响

Tab.2 The effect of spectra on the total length of Takifugu rubripes

注：数据均表示为平均值±标准误(Mean±SE) (=15)；相同字母代表各处理组间无显著性差异(>0.05)，不同字母表示各处理间差异显著(<0.05)，下同

Note: Values are expressed as Mean±SE (=15). The same letter indicates no significant difference between the treatment groups (>0.05), and different letters indicate significant differences between treatments (<0.05), the same as below

第6天，不同光谱组体长未出现显著性差异，7 d时，绿光组的仔稚鱼体长与蓝光组出现显著性差异(0.05)，7、8 d，黄光组体长显著高于绿光组(0.05)。同样，17 d后，蓝光组体长生长较快，在22 d时显著高于绿光、白光组(0.05)。23 d，蓝光组的体长平均值达到最高，但与其他光谱组相比，无显著差异，白光组仔稚鱼体长变化情况与全长相似。

第6天，蓝光组红鳍东方鲀仔鱼头长与绿、黄光组出现显著性差异(<0.05)，7 d时，不同光谱处理组的差异不显著，在第11天，黄光组与蓝、绿光组无显著性差异，但与白光组差异性显著(<0.05)。在第17天，蓝、绿、黄光组显著高于白光组(<0.05)。在第23天时，黄光组的头长最大。

在实验第6天时，绿光处理组仔稚鱼的躯干长与蓝、黄处理组出现显著性差异(0.05)，第8~11天，仔鱼的躯干长逐渐减小，而黄光组仔稚鱼的躯干长从第7天开始逐渐增长，在第10天时，黄光组的躯干长显著高于绿光组(0.05)；17 d后，白光组与绿光组无显著性差异，第23天，蓝光组下仔稚鱼的躯干长最大。

在6、7 d时，不同光谱下仔稚鱼的尾长无显著性差异，在第8天，蓝、白光谱下的尾长与绿光组出现显著性差异(0.05)，8 d时，蓝、黄、白光组显著高于绿光组(0.05)，20、23 d，蓝、绿、黄组之间无显著性差异，且平均值都高于白光组。

图1 光谱对红鳍东方鲀仔稚鱼形态性状的影响

在不同光谱下初孵仔稚鱼眼径无显著性差异，在第7、8天，绿光组显著高于蓝光组(0.05)。在第9、10天，各处理组无显著性差异。11 d后，不同光谱下的眼径呈现不规则的“M”型趋势，在第17天后，黄光组下的眼径一直高于其他处理组。

对于红鳍东方鲀仔稚鱼的体高，仅在8、14、23 d时，不同处理组之间出现显著性差异。在第8天，绿光组显著高于黄光组(0.05)，与蓝、白光组无显著性差异。14 d，白光组显著高于蓝、绿光组(0.05)，但与黄光组无显著性差异；第23天，黄光组与绿光组有显著性差异(0.05)，与蓝、白光组无显著性差异。

2.3 光谱对红鳍东方鲀生长相关基因表达量的影响

不同光谱对基因相对表达量有显著影响，蓝光下，基因表达量显著高于黄、白光组(0.05)，但与绿光组的表达量无显著性差异(图2A)。对于基因，不同光谱下基因的表达量无显著性差异，但蓝光下基因的表达量最高，依次为黄、绿、白光(图2B)。蓝、绿光下基因表达量较高，但与黄、白光组的表达量之间无显著性差异(图2C)。

图2 光谱对红鳍东方鲀生长相关基因表达的影响

Fig.2 The effect of spectra on the expression of growth-related gene in

3 讨论

研究表明，鱼类受精卵的孵化受温度、盐度、pH、溶解氧等环境因子的影响(杨明秋等, 2012; 戈志强等, 2003)，而光作为重要的环境因子之一，对鱼类受精卵的孵化、仔鱼的生长也有着重要的影响(柳学周等, 2004; Villamizar, 2009; Blanco-Vives, 2010)。本文研究了不同光谱(蓝、绿、黄、白)对红鳍东方鲀受精卵孵化和仔稚鱼形态性状的影响。结果显示，蓝、绿、黄光处理下的第6天，受精卵开始孵化，且各组之间的全长、体长、尾长、眼径、体高均无显著差异，但蓝光下的头长显著高于绿、黄光组，绿光下的躯干长显著高于蓝、黄光组的躯干长。而白光组在第8天开始孵化出仔稚鱼。分析认为，在蓝、绿和黄处理组中，受精卵受到单色光刺激，促进了受精卵的孵化，导致蓝、绿和黄光组中受精卵比白光组提前2 d孵化。Downing等(2002)关于光谱(蓝、绿和白)对黑线雪鱼()受精卵影响研究中，并未发现光谱对黑线雪鱼的孵化有显著性差异，这可能是由于不同物种对不同光谱的敏感度不同，具有种属特异性(Boeuf, 1999)。在实验结束时，蓝光下仔稚鱼的全长、体长、躯干长和尾长的平均值最大，黄光下仔稚鱼头长、眼径和体高的平均值最大。分析认为，这可能是由于仔稚鱼不同性状对不同光谱的敏感度不同。蓝色光谱对欧洲舌齿鲈()、塞内加尔鳎()、大西洋鳕鱼()仔鱼的生长有促进作用(Villamizar, 2009; Blanco-Vives, 2010; Sierra-Flores, 2016)，这与本研究结果相似。欧洲舌齿鲈受精卵在孵化后30 d，蓝光可以促进其仔鱼生长；同时，对于其器官发育，蓝光下仔稚鱼牙齿发育率为100%，白光、红光下的发育率分别为63%、40%，鱼鳔也是蓝光下发育的最好，体长、体重也一样(Villamizar, 2009)。本研究中，蓝光促进了仔稚鱼的生长(全长、体长、躯干长和尾长)。由此，可以推测，优势光谱对仔鱼生长和器官发育的影响相似。

环境因子如温度、光周期、光谱会影响生物体内激素的变化(Kim, 2016)，生长激素轴是脊椎动物生长的调节核心，可以通过刺激细胞分化直接影响生长，导致细胞增殖，从而促进生物的生长(Björnsson, 1997; Duan, 1997; Green, 2010)。本研究中，蓝光下基因的相对表达量显著高于黄、白光组，而、基因在不同光谱下的表达无显著性差异，但蓝光组基因表达量均较其他光处理组高。从图4、图5可以看到，蓝、黄光组的尾长、头长发育较快，在前10 d，头长处于快速生长阶段。对于体高，各光谱处理组总体变化不大，分析认为，处理组中的仔稚鱼体内卵黄囊在不断消耗，体积逐渐变小，而仔稚鱼又在不断生长，故在实验前20 d，体高的变化幅度不大，待卵黄囊完全消耗时，体高的发育出现明显差异(图7)。

综上所述，蓝、绿、黄光处理组的受精卵比白光处理组早2 d孵化；在实验结束时(第23天)，蓝光处理组仔稚鱼的全长、体长、躯干长和尾长生长最快，黄光处理组头长、眼径和体高生长较快。对于生长相关基因，蓝光下的生长相关基因相对表达量最高，对于基因，不同光谱下基因的相对表达量无显著性差异，因此，建议在红鳍东方鲀受精卵孵化时，可采用蓝色光谱照射，以减少孵化时间，促进仔鱼生长，缩短养殖周期，节约成本。

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Effects of LED Spectra on Morphological Characters and Gene Expression of Growth inLarvae

WEI Pingping1,3, LI Xin1,3, ZHANG Junpeng1,3, FEI Fan1,3, MA He1,3, GAO Dongkui1,3, SONG Changbin4, CHEN Tao5, LIU Ying1,2,3①

(1. Dalian Ocean University, Dalian 116023; 2. Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266000; 3. Liaoning Aquaculture Facilities and Equipment Engineering Research Center, Dalian 116023; 4. China Academy of Sciences Institute of Semiconductors, Beijing 100083; 5. Led Cooler Technology Co. Ltd, Shenzhen 518000)

Four LED spectral parameters were set, which were blue (450 nm), green (525 nm), yellow (590 nm), and white (400~780 nm), water temperature was controlled at (22±1)℃, photoperiod was 16L:8D. The light intensity was set at 200 mW/m2. The results showed that the fertilized eggs ofunder the blue, green and yellow light hatched 2 days earlier than the white light. At the end of the experiment, the full length, body length, trunk length and tail length of the larvae under the blue light were the most. Under yellow light, the head length, eye diameter, and body height showed the fastest growth. For growth genes, the expression of growth hormone () gene under the blue light was significantly higher than yellow and white light group (<0.05), but there was no significant difference with green light group. There was no significant difference in gene expression for growth hormone receptor 1 () and insulin-like growth factor type() under different spectra, but the expression ofgene under blue light was the highest. The results showed that LED spectrum (blue, green, and yellow) promoted the hatching of the fertilized eggs of, and the blue spectrum is beneficial to the growth and development of thelarvae. The paper provided a scientific reference for the incubation of.

LED Spectrum;larvae; Morphological character; Gene expression of growth

S965.335

A

2095-9869(2020)01-0162-07

10.19663/j.issn2095-9869.20181207001

* 国家重点研发计划项目(2017YFB0404000)资助 [This work was supported by National Key Research and Development Program (2017YFB0404000)]. 魏平平, E-mail: 335613556@qq.com

刘 鹰，教授，E-mail: yingliu@dlou.edu.cn

2018-12-07,

2019-01-02

http://www.yykxjz.cn/

魏平平, 李鑫, 张俊鹏, 费凡, 马贺, 高东奎, 宋昌斌, 陈涛, 刘鹰. LED光谱对红鳍东方鲀仔稚鱼形态性状及生长相关基因表达的影响. 渔业科学进展, 2020, 41(1): 162–168

Wei PP, Li X, Zhang JP, Fei F, Ma H, Gao DK, Song CG, Chen T, Liu Y. Effects of LED spectra on morphological character and gene expression of growth inlarvae. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(1): 162–168

LIU Ying, E-mail: yingliu@dlou.edu.cn

(编辑 冯小花)