股骨头缺血性坏死造模方法的研究进展

★ 杨佛 夏汉庭 曹端广 杨凤云（.江西中医药大学 南昌 330004；.江西中医药大学附属医院 南昌 330006）

股骨头缺血性坏死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是临床上最常见的骨坏死，可分为创伤性和非创伤性两大类。创伤性ONFH多由于股骨颈骨折破坏股骨头的血供导致的，非创伤性ONFH的病因与过量使用糖皮质激素及长期酗酒有关。本病严重影响患者的劳动能力与生活质量，晚期股骨头塌陷后可导致患者残疾［1］。近年来由于糖皮质激素的不规范使用以及酗酒人群的增加，临床上ONFH患者越来越多，且呈年轻化态势，给家庭及社会带来了巨大的经济负担，也给劳动密集型企业埋下了巨大的隐患［2］。ONFH早期可选择髓芯减压和打压植骨等保髋术式治疗，但疗程长且疗效欠佳，加上ONFH患者早期症状轻微，且X线及CT对ONFH辅助诊断不敏感，导致很多患者错过了就诊的黄金时机。晚期就诊患者再行保髋治疗往往成效甚微，尽早行关节置换术才能获得满意的疗效。但关节置换术的人工关节也有一定的使用寿命，后期需要翻修，且翻修难度加大，失败率高［3］。事实上，ONFH的病因和发病机制至今尚未完全阐明，其中一个至关重要的原因就是在基础研究领域中缺乏理想的ONFH模型，使得科研及临床工作者对于ONFH的病理特征得不出突破性认识。基于此，笔者搜集近几年国内外较理想的ONFH模型制作方法并进行综述，希望能为ONFH的研究者提供理论参考。

1 液氮冷冻造模

液氮冷冻法由于具有安全性高、造模时间短、可重复性高等优点，近几年受到越来越多ONFH研究者的青睐。谭震等［4］使用股骨头钻孔加液氮灌注法，成功在山羊身上建立了ONFH模型。其在实验中选取12只山羊，一侧髋关节为实验组，另一侧为对照组进行研究。将山羊麻醉后备皮、消毒、铺巾，从大转子上方切口皮肤，分离肌肉，暴露髋关节囊，继而T形切开关节囊，用直径3.8 mm的钻头从大转子处平行股骨颈向股骨头钻一长约1 cm的孔道，用自制漏斗插入孔道中，倒入液氮持续冷冻1 min，后用温生理盐水冲洗并逐层缝合伤口。2周后HE染色结果示实验组骨小梁稀疏，大量骨细胞坏死，空骨陷窝率达（59.2±5.2）%，股骨头总坏死率达91.67%。李海冰等［5］采用类似方法造模也获得了较理想的模型。其以22只新西兰大白兔右侧髋关节作为实验组进行研究，常规麻醉、备皮、消毒、铺巾后，在右髋关节外侧作一横行切口，逐层分离肌肉、髋关节囊直至暴露股骨头。然后用直径3.5 mm的钻头向股骨头前内侧骨与软骨交界处钻一深约4 mm的孔，再用mini刮匙沿着孔道刮除部分松质骨直达软骨下，再用针沿着孔道注入液氮冷冻1 min，继而生理盐水复温并缝合切口。造模4周后X线显示实验组股骨头塌陷，8周HE染色结果示关节软骨大片剥脱，可见大量骨碎片。22只实验动物中有21只造模成功，成功率达95.5%。曲春涛等［6］将液氮造模法结合射频加热技术对造模方法进行了改良，并且选用与人类股骨头受力情况高度类似的两足动物鸸鹋进行研究。其在实验中以股骨大转子为中心，在导航装置引导下向股骨头钻孔到达关节软骨下，然后插入闭合回路冷热交替治疗探针，先灌注液氮冷冻3个循环，每次9 min，冷冻后射频加热治疗，3个循环后取出治疗头，逐层缝合切口。造模后第6周X线显示软骨下月牙形阴影，组织学显示大量骨小梁碎裂，骨细胞死亡；第16周MRI显示部分鸸鹋股骨头塌陷伴髋关节半脱位。阮康明［7］运用液氮冷冻法建立了早期犬ONFH模型。其选用8只beagle犬作为实验组进行研究，将犬麻醉后以右侧股骨颈为中心作一弧形切口，分离浅层软组织直至暴露股骨头，用无菌纱布覆盖保护股骨头周围组织，然后用浸泡过液氮的棉球湿敷股骨头，每次3 min，湿敷完1次后用37℃生理盐水冲洗复温，然后继续湿敷，共5个循环。造模第6周HE染色结果示股骨头关节软骨出现缺损，出现大量空虚骨陷窝。第12周CT提示骨质疏松，股骨头出现囊状透亮区；MRI显示股骨头关节软骨下骨折。王海涛等［8］选取18只新西兰大白兔一侧股骨头进行研究，实验时先用克氏针向股骨头钻一直径2 mm、深4 mm的孔，再用直径1 mm、头端直径为1.2 mm的小圆球的特质探针蘸取液氮后涂抹于孔内，然后用生理盐水复温，共6个循环。造模后第2周实验组空骨陷窝率达（73.33±7.21）%，到第8周时空骨陷窝率高达（88.13±8.12）%，且股骨头大范围坏死。Jiang W等［9］采用液氮冷冻法成功建立了鸵鸟ONFH并塌陷模型。其选用18只与人体体重相近的鸵鸟，麻醉后以左侧大转子为中心作一切口，分离皮下软组织，切开关节囊，暴露股骨头，接着用直径3 mm的钻头向股骨头软骨承重区钻一深约3.5 cm的孔，然后沿着孔道置入探针，注入液氮，持续2 min，2 min后用40℃盐水复温，复温3 min，然后重新注入液氮，循环3次，3次结束后逐层缝合切口。术后12周发现手术侧股骨头塌陷。

2 激素法造模

激素性股骨头缺血性坏死（steriod-induced osteonecrosis of the femoral head，SONFH） 造 模 法可分为单纯激素法、激素联合马血清法和激素联合脂多糖法。张立岩等［10］采用单纯激素法获得了兔SONFHARCO分期2期病变模型。实验组采用臀肌注射地塞米松磷酸钠（10 mg/kg，每3天1次，共14次）方法造模。6周后MRI显示实验组股骨头内骨小梁稀疏，软骨下骨坏死，HE染色结果示部分骨小梁断裂，空骨陷窝增多，空骨陷窝率达（49.0±0.3）%。佟鹏等［11］采用激素联合马血清方法得到了满意的兔SONFH模型。其选取20只新西兰大耳白兔进行研究。实验组10只先经耳缘静脉注射马血清（10 mL/kg），2周后再注射1次，注射2次后臀部注射醋酸泼尼松龙（8 mg/kg，1天1次，连续6天）。造模8周后行X线示实验组骨密度明显降低，骨小梁重度疏松；HE染色结果示实验组股骨头与股骨颈移行处见大量骨小梁碎片，骨小梁中骨细胞坏死；MRI结果示实验组双侧股骨头均出现典型的双线征。总的造模效果显示实验组中10只兔子有8只造模成功，造模成功率达80%。董维等［12］同样选取大白兔作为研究对象，但是是采用激素联合脂多糖法进行造模。其在实验中共纳入30只大白兔进行研究，实验组20只先经耳缘静脉注射脂多糖（10 µg/kg），24h后右侧臀肌注射甲强龙（20 mg/kg，1天1次，连续3天）。6周后X线片示右侧股骨头骨质疏松，部分骨小梁模糊不清；HE染色结果示实验组骨小梁碎裂，骨细胞大量坏死，空骨陷窝数量增多，骨髓腔内充满大量脂肪细胞。实验组中共15只大白兔出现了骨坏死，坏死率为75%。喻钧伦等［13］对激素联合脂多糖造模法进行了改良。先经兔耳缘静脉注射脂多糖（10 µg/kg），24 h后臀肌注射醋酸泼尼松龙（20 mg/kg，1天1次，共3次）为对照组；改良组则先臀部注射青霉素及阿米卡星预防感染，24 h后再经臀部注射醋酸泼尼松龙（20 mg/kg），再过24 h经兔耳缘静脉注射脂多糖（5.0 µg/kg），注射脂多糖后间隔24 h分两次注射醋酸泼尼松龙（每次剂量均为20 mg/kg）。结果对照组10只大白兔死亡8只，死亡率达80%；实验组18只大白兔死亡9只，死亡率为50%。说明改良组的方法能降低动物的死亡率。张琳等［14-15］则对脂多糖与SONFH之间的量效关系进行了研究。其设置3个实验组，脂多糖注射剂量分别为 10 µg/kg、20 µg/kg、40 µg/kg，联合臀肌注射甲强龙（20 mg/kg）造模。造模后从骨密度、骨生物力学及组织学结果评定得出，脂多糖注射剂量为40 µg/kg时造模效果最好。章建华等［16］通过实验比较了不同激素类型对SONFH造模效果的影响，结果发现相比地塞米松和泼尼松龙，运用甲强龙（20 µg/kg）造模对股骨骨密度的破坏最明显，通过最大弯曲位移和杨氏模量的比较也得出甲强龙对大鼠股骨生物力学影响最大的结论。李超等［17］以“提高SONFH存活率”为出发点进行了研究，其在实验中设置了3组实验组，分别为激素联合脂多糖组，激素联合脂多糖加庆大霉素组，激素联合脂多糖加庆大霉素及泮托拉唑组。造模6周后三组存活率比较发现，激素联合脂多糖加庆大霉素及泮托拉唑组存活率最高，达87.5%。

3 酒精性ONFH造模

酒精性ONFH多见于青年人。目前对于酒精性ONFH的造模方法有灌胃法和股骨头局部注射法。杨云等［18］用灌胃法给Wistar大鼠灌46°白酒（10 mL/kg，1天1次，连续6个月），3个月时HE染色结果示股骨骨小梁变细，空骨陷窝开始增加，造模6个月时股骨头软骨下区域出现典型的股骨头坏死表现，股骨头骨小梁稀疏，空骨陷窝明显增加。李宏宇等［19］选取48只新西兰大白兔进行研究，实验组予42%乙醇灌胃（10 mL/kg，1周3次，连续6个月），造模3个月后空骨陷窝率明显增加，骨内压为（26.82±3.85）mm Hg，跟对照组相比差异有统计学意义。范猛等［20］则采用股骨头局部注射乙醇建立了ONFH模型。其选用大型两足类动物鸸鹋进行研究，通过一根长10 cm、直径1.5 mm的穿刺针向股骨头注入无水乙醇8 mL诱导造模，造模3个月HE染色结果示实验组出现大量空骨陷窝，骨小梁形态不规则；造模6个月HE染色显示实验组空骨陷窝存在活骨，表明造模6个月后股骨头出现了自我修复过程。同样是运用股骨头注射无水乙醇，Wang C等［21］在犬身上成功制作了ONFH模型。其先构建虚拟股骨3D模型，同时打印出导针进针需要的套管和模型外壳，然后使用Geomagic Studio软件选出最佳进针方位。开始正式实验时先将犬麻醉，再借助导航模型，将直径1.5 mm的K导针沿着股骨大转子基底部向股骨头中心钻孔，直至离股骨头关节软骨面大约5 mm处，取出K导针，沿着孔道置入一直径约1.6 mm套管，然后连接压力注射器，注入4 mL的无水乙醇，注射完后逐层缝合。造模后6周X线检查示6只犬中有2只出现股骨头节段扁平，1只出现股骨头骨折；第9周时发现6只犬中有2只影像学显示髋关节狭窄伴继发性关节炎。HE染色结果示第3周时股骨头坏死区域中骨小梁稀疏，骨髓腔中的造血细胞减少；到第6周时坏死区域成纤维细胞增生、骨小梁开始重吸收；第9周时骨髓腔充满了增生的成纤维细胞，破骨细胞沿着骨小梁的方向排列。

4 手术造模

股骨头的血供主要来自外骺动脉、下干骺端动脉和内骺动脉。股骨颈骨折时容易损伤这些血管，如果得不到及时的手术治疗很容易导致股骨头出现缺血性坏死。因此在基础实验中可以通过结扎供应股骨头血供的血管来达到ONFH造模的目的。Hwang等［22］在实验中纳入27只新西兰大白兔进行研究，分为W、B、M三组，每组9只。W组采用直径0.4mm的钢丝绳环绕右股骨颈阻断供应股骨头的血供进行造模；B组在W组造模条件基础上加用电极烧灼5s造模；M组采用肌注醋酸泼尼松龙（20mg/kg）方法造模。造模2周后组织学检查示，B组较W组骨坏死程度高，W组骨坏死程度高于M组；免疫组织学结果显示B组高表达Tunel细胞。这在一定程度上说明ONFH手术造模效果比激素造模效果好，且用时短。Qin Wen等［23］在实验中制作了兔ONFH模型，其将所有附着在股骨头上的韧带分离，同时从股骨颈基底部截断股骨颈，然后逐层缝合。造模后3周MRI显示实验组2/3的动物出现软骨下低信号影。造模后3天即能明显观察到实验组股骨头HE染色变化，骨髓细胞减少，伴有骨髓细胞形状的改变，骨髓腔出血，同时观察到成纤维细胞。辛大森等［24］以研究“阿仑膦酸钠防治股骨头塌陷的效果”为出发点，选取45只SD大鼠进行研究，其中30只采取手术造模。麻醉后备皮，消毒，铺巾，取左髋部外侧3cm切口，分离皮下组织，切开关节囊，暴露股骨头，使髋关节脱位，切断圆韧带，剔除股骨颈近端骨膜组织，冲洗后分层缝合。5周后安慰剂组HE染色结果示股骨头组织内活骨和死骨交替存在，空骨陷窝＞50%。

5 小结

综上所述，ONFH常用液氮冷冻法、激素法、酒精灌胃及局部注射法、手术法进行造模。每种造模方法都具有各自的优点。液氮冷冻法能在短期内造出理想的ONFH模型，且动物整体死亡率低，实验可重复性高，是一种较理想的造模方法［25］；激素造模法在基础实验中研究人群较多，且造模效果符合临床上ONFH病变过程，因此研究价值较大；酒精灌胃及局部注射法、手术法造模效果好，且造模后动物病变过程比较符合临床ONFH病变过程。但每种造模方法都有其不足之处：液氮造模法虽然成功率高，但不是针对ONFH的病因进行造模，且应用液氮的剂量和时间没有统一的标准。激素造模法中单纯激素法造模时间较长，激素联合马血清容易引起动物休克，导致死亡率偏高；激素联合脂多糖方法得到大多数研究者的认可，但激素的种类繁多，目前尚没有统一的标准，且脂多糖的用量也没有公认的标准或标准范围。酒精法中局部注射无水乙醇法术中操作过程较复杂，术中多次透视对实验人员伤害较大。手术法造模对动物股骨头周围软组织损伤较大，且难以造出塌陷型ONFH模型［26］。

在造模动物的选择上，有四足动物大白兔、大鼠、犬，也有两足动物鸸鹋、鸵鸟。两足动物其髋部受力特点与人类类似，因此是研究者们一致认同的ONFH造模理想动物。但是由于其体型较大，具备的饲养条件及手术条件较严格，加上其价格昂贵，来源少，研究成本高，因此未能在基础实验中得到大量的应用。大鼠价格较便宜，饲养条件要求较低，但由于其股骨头较小，不利于影像学观察及组织形态学观察。犬类股骨头较大，但由于饲养成本高，且造模要求高，因此用于研究ONFH模型的例子也较少。大白兔性格温和，存活率也高，股骨头较大，因此是基础领域研究者用来造模的合适动物。

因此，ONFH的研究者可以根据自己的实验需要，同时结合自身的实验条件，选择对应的造模方法进行研究。近年来伴随着科技的进步，ONFH造模方法得到不断的完善而日趋理想。但我们也要认清这样一个事实：在ONFH造模方面仍需要投入大量的基础实验研究，其中的很多造模方法还需要不断的实验检验和完善，对于造模药物的用药剂量没有确定的标准或标准范围，同时造模药物的剂量及用药时间与造模效果之间的关系研究得不够透彻。相信随着微创和3D打印技术的发展，ONFH造模方法能取得更大的突破。